自放射增敏的亲电子理论提出以来, 对肿瘤放射增敏剂及其作用机理的研究已有50多年的历史^[1]。研究最多的是含硝基的亲电子化合物, 其中最早开发的是咪嗦硝唑(misonidazole, MISO), 它是2-硝基咪唑类乏氧细胞增敏剂。但几项临床试验研究结果发现MISO合并常规放疗无明显增敏效果。主要原因是硝基化合物在肿瘤组织药物浓度低, 不足以产生明显的增敏效果, 该药脂溶性高, 能渗透到中枢神经和外周神经组织, 导致明显的神经毒性^[2-3]。各国学者对硝基咪唑类化合物进行了大量的减毒增效研究, 包括改善药物的脂水分配系数, 根据肿瘤组织特点添加肿瘤特异性基团等, 合成了一系列硝基类增敏剂^[4-6]。其中硝基吲唑类化合物也属于亲电子类乏氧增敏剂, 具有较好的增敏效果, 本实验在硝基吲唑母核上引入苯丙氨酸合成了N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠作为肿瘤乏氧放射增敏剂, 并对该化合物的增敏活性进行了初步研究。

1 材料与方法 1.1 材料与仪器

吲唑-3-羧酸购自常州瑞明药业; L-苯丙氨酸乙酯盐酸盐购自上海翰宏化工有限公司; 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC.HCL), 1-羟基-苯并-三氮唑(HOBt)购自上海共价化学科技有限公司; 其他试剂均为市售分析纯, 不经纯化直接使用。Hela细胞由南开大学分子生物所提供, 培养于10%胎牛血清的RPMI1640培养基, 37℃, 5% CO₂, 3~4d传代一次。昆明种小鼠, 雌雄各半, 鼠龄6~8周, 体重18~22 g; 由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。可移植性实验肿瘤H22肝癌瘤株, 由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供。磷酸盐缓冲液(PBS), 培养基, 胎牛血清等购自Hyclone公司。¹³⁷Cs射线(Cammacel 40, 加拿大)照射源, 剂量率0.8077 Gy/min。

1.2 N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的合成 1.2.1 合成路线

N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠由起始原料吲唑-3-羧酸经混酸硝化后与苯丙氨酸的酯缩合而成。合成路线如图 1所示。

1.2.2 N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的制备

100 ml三口瓶装机械搅拌, 加入21 ml发烟硝酸, 冷却下滴入20 ml浓硫酸(95%~98%), 使温度不超过0℃。滴毕, 分次加入吲唑-3-羧酸6.7g (0.05 mol)。控制温度不超过0℃。加毕, 室温搅拌3 h后将反应液倾入200 g碎冰中, 抽滤收集固体, 干燥, 用95%乙醇重结晶, 得白色粉末状固体(5-硝基吲唑-3-羧酸), 抽滤收集得6.5 g。收率74%。m. p.259℃~260℃。

5-硝基吲唑-3-羧酸1.1g(5 mmol), 苯丙氨酸乙酯盐酸盐1.1g(6 mmol), EDC.HCl 1.2g(6 mmol), HOBt 0.8g(6 mmol), 二氯甲烷50 ml, 依次加入圆底瓶中, 滴入三乙胺0.9 ml(6 mmol)。室温搅拌5 h, 过滤, 滤液水洗, 无水硫酸钠干燥, 蒸干, 加入10% NaOH水溶液10 ml, 室温下搅拌1 h, 加入活性炭0.5 g, 煮沸, 过滤, 盐酸调pH值为3, 抽滤收集析出的固体, 用10% NaOH溶解后加入无水乙醇, 抽滤收集析出的固体, 干燥。得灰白色粉末0.73g, 即为终产物。m.p.349℃~350℃降解。收率39%。

1.2.3 结构确证与含量测定

终产物经核磁共振氢谱和红外光谱进行鉴定, 并经高效液相色谱测定含量。

1.3 N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的放射增敏作用 1.3.1 对Hela细胞的增敏作用

取指数生长期的Hela细胞, 接种于96孔板, 加入不同浓度的药物处理。每种浓度设3个平行样, 37℃、5% CO₂培养, 药物作用1h后通高纯氮乏氧0.5 h, 乏氧状态下以0~8 Gy照射, 照后正常培养48 h。MTT法检测细胞存活率。存活率(SF) =实验组吸光度值/对照组吸光度值。实验重复三次, 取平均值, 以照射剂量为横坐标, 存活率为纵坐标, 绘制药物浓度-效应曲线。

1.3.2 体内放射增敏实验

H22肿瘤细胞悬液(浓度为1 × 10⁷/m1), 0.1 ml/只注射于小鼠右后脚背侧皮下。瘤体体积达到约150 mm³时随机分组进行实验。将移植瘤小鼠随机分成4个大组, 8个亚组, 每个亚组8只。分别为:空白对照组(乏氧方法:采用外科动脉夹, 夹住小鼠荷瘤肢体的根部, 阻断小鼠荷瘤肢体血流10 min)、乏氧给药组(乏氧方法同上, 高、中、低3个亚剂量组50、100、200 mg/kg单次腹腔注射给药)、乏氧照射组(乏氧方法同上, 给予6Gy单次照射)、乏氧照射+给药组(乏氧及给药方法同上, 给药后1小时给予6 Gy单次照射)。照射后尽快恢复血液供应。治疗开始后, 用游标卡尺测量肿瘤的三个直径a, b, c按公式V = a × b × c × π/6计算肿瘤体积。计算肿瘤体积相对于初始体积的倍数, 绘制肿瘤体积增长倍数对时间的曲线, 计算肿瘤体积增至实验开始时体积的约3倍所需时间与空白对照组所需时间的差值(TGD)。药物加照射组的肿瘤生长延迟时间与单纯照射组(对照)的肿瘤生长延迟时间之比作为放射增敏比(SER), SER = TGD_增敏治疗/TGD_单照射。

2 结果与讨论 2.1 N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的制备

吲唑-3-羧酸经混酸硝化后以EDC.HCL为缩合剂与苯丙氨酸乙酯盐酸盐缩合, 再经NaOH处理得到N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠。该制备过程总收率为28.8%。

由其红外图谱可知该化合物具有硝基, 酰胺基等特征基团。将N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸做成钠盐与其酸的氢谱对比判断除羧基氢外其他各氢仍在, 结合红外与核磁共振测试结果可知该化合物结构为N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠。

以水:甲醇(40: 60)为流动相, 1 ml/min, ODS柱(waters公司)进行含量测定, N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠出峰时间为2.6 min, 含量为98.1%。可以满足后续实验要求。

2.2 N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的放射增敏作用^[7] 2.2.1 体外实验

Hela细胞加药处理后给予0~8 Gy照射其存活曲线如图 2。由图可见给药后三个剂量组的存活率均低于单照射组, 表明该药对Hela细胞具有一定的放射增敏作用。

2.2 对小鼠肿瘤模型的放射增敏作用

根据各组小鼠肿瘤平均体积, 绘制肿瘤生长倍数对时间曲线。N -(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠的高、中、低剂量组乏氧状态下的肿瘤生长倍数曲线与单纯乏氧组肿瘤生长倍数曲线见图 3a, 各治疗组与单照射组的生长倍数曲线见图 3b。

由图 3a可见单给药各组肿瘤增长倍数曲线与空白对照组趋势相同, 表明单给药各剂量组对肿瘤生长基本无作用。图 3b可见各剂量组合并放射后肿瘤增长速度低于空白对照组, 其中单照射与高、中、低剂量合并照射组的TGD分别为4 d、7 d、8 d、5 d。则高、中、低三个亚剂量组的SER值分别为1.75、2.0、1.25, 平均为1.67。表明该药对小鼠H22肿瘤模型具有一定的放射增敏作用。

实体瘤中的乏氧细胞对放疗有明显的抵抗作用, 易导致肿瘤放疗失败甚至复发、转移, 经过对乏氧细胞放疗抵抗的研究提出了放射增敏剂的概念。英国科学家Adams发现含硝基化合物具有放射增敏作用, 并提出了增敏作用的亲电子理论, 使射增敏剂的研究快速发展。硝基吲唑类化合物也属亲电子类乏氧增敏剂, 具有较好的放射增敏活性。本实验通过缩合剂法合成了N-(5-硝基吲唑-3-甲酰)苯丙氨酸钠, 并经红外与核磁共振确定了结构, Hela细胞乏氧模型与小鼠肝癌H22移植瘤乏氧模型增敏实验表明该化合物具有一定的乏氧增敏效果, 值得进一步研究。