外周血淋巴细胞是对电离辐射较敏感的细胞之一, 已有研究表明长期低剂量受照可以引起神经系统、造血系统、免疫系统等多方面的生物效应改变。人外周血淋巴细胞微核检测在相关职业暴露人群遗传物质损伤程度评估以及生态环境监测等方面被广泛应用。微核试验以其操作方便、快捷、成本较低等优点成为判断放射从业人员受到辐射伤害程度的重要手段之一^[1]。2007年卫生部颁布的《放射工作人员职业健康管理办法》中将微核检测作为放射工作人员在岗期间健康体检的必检常规项目之一。为了提高微核检出的准确性和阅片效率, 应严格遵守实验操作规程。笔者所在实验室是福建省漳州市能够承担放射工作人员健康体检微核项目检测的单位, 现将近几年工作中总结的一些具体的操作方法和注意事项作如下总结报道。

1 材料与方法 1.1 样本来源

进行健康体检的漳州市各级医院从事放射工作的相关人员。

1.2 接种

抽取受检者的静脉血接种于RPMI-1640组合培养液内, 写上姓名或编号, 摇匀, 并在培养瓶中加入适量的PHA。

1.3 培养

将接种后的培养瓶放置于37℃恒温培养箱内培养68~72 h, 避免放在加热板上或靠着加热板。

1.4 收获

① 收集细胞:将培养好的细胞悬液混匀倒入事先编好号的离心管中, 1 500 rpm离心8 min, 弃上清液。②低渗:加入0.075 mol/L氯化钾低渗液8 ml, 用滴管轻轻吹打混匀, 吹打力度均匀且适中, 置于37℃恒温水浴箱中低渗8~10 min。③预固定:低渗结束后取出加入约1 ml固定液, 轻轻吹打后1 500 rpm离心8 min。固定液应现用现配。④固定:弃上清液, 沿管壁缓缓加入8ml固定液, 轻轻吹打混匀, 1 500 rpm离心8 min; 弃上清液, 再重复固定1~2次。弃上清液后, 视沉淀细胞数量多少加入适量固定液打匀。⑤滴片:吸取细胞悬液滴在洁净的预冷的载玻片上, 滴片的高度大约为1 cm, 自然风干, 编号。

1.5 染色

1:10 Giemsa或者瑞式染液染色2~3 min, 冲洗多余染液, 风干。

1.6 镜检分析

在油镜下每例计数1 000个已转化、胞浆完整且厚度适中的淋巴细胞。微核应位于完整的淋巴细胞胞浆内, 小于主核1/3且呈圆形、椭圆形, 与主核相离或相切, 着色与主核一致或稍浅, 不折光。结果以千分率(‰)表示。

2 质量控制注意事项

外周血淋巴细胞微核的制备过程, 是一个经过多个试验步骤, 各步骤之间环环相扣, 互相影响的过程, 其中一个细节未处理好都可能影响微核玻片的质量, 从而影响阅片的效率以及微核检出率。因此, 在微核标本制备过程中应严格遵守实验室操作规程, 尤其应该做到以下几点。

2.1 防污染

接种前要对生物安全柜进行消毒及灭菌, 防止细胞在接种时和培养过程中的细菌污染。

2.2 接种

血液量要适当, 一般以25~30滴为宜, 可依据各人接种手势不同所致的血滴大小不一以及血液浓度的不同适当调整接种血液滴数, 太少不易观察, 太多不容易打散。

2.3 血液的新鲜度

血液最好现抽现种, 但也有实验表明血样培养前放置50 h之内, 对微核率分析无显著影响^[2]。

2.4 培养温度

细胞培养过程中温度应严控在(37 ± 0.5)℃。

2.5 低渗

微核标本制备的关键步骤, 其目的是使红细胞膜破裂, 淋巴细胞膨胀。在实验过程中要不断总结经验, 根据接种量及细胞的生长情况适度调整低渗液的量以及温浴时间。低渗不足则胞浆太厚看不清, 可能导致微核漏检; 反之, 低渗过度没有胞浆也无法分析。低渗后吹打细胞时一定要沿着管壁吹打, 并且保证动作要轻, 以防引起膜破裂。

2.6 固定液

应现用现配。往离心管中加入固定液时最好沿着管壁缓慢加入。

3 讨论

随着核科学的在工业、医疗等领域的快速发展和广泛应用, 以及大量的具有致畸因素的外来化合物如药物、食品添加剂、化妆品、农药、环境污染物的被广泛应用甚至滥用于生产生活中, 人体细胞受到外界损害而导致遗传损伤的几率越来越高, 尤其是长期接触放射线及有害化学物质的工作者。外周血淋巴细胞微核测定因为能直接反映辐射损伤而成为放射工作人员职业健康体检的特定检测项目。随着职业健康法的实施以及相关工作人员意识的提高, 参加微核检测的人员逐年增多。放射工作人员职业健康检查一般在统一的时间进行检查, 这就要求我们提高技术水平, 提高工作效率, 才能保证在较短的时间内完成较大量的工作。但是, 细胞遗传学工作存在着多种不稳定的因素, 如研究对象为活细胞, 手工操作环节多, 因而在实验环节中易受各种主客观因素的影响而导致结果的偏离^[3]。外周血淋巴细胞微核标本制备操作过程中任何一步出现失误都可能造成微核片质量问题, 降低了阅片的效率甚至影响分析结果。因此, 在实验全程中都必须严格遵守实验操作规程, 做好总结, 不断根据本实验室的实际情况改进方法搞好质量控制^[4], 才能制备出优良的淋巴细胞微核片, 保证检测结果的准确性, 及时准确反映辐射损伤情况, 为患者诊断和治疗提供依据^[5]。此外, 也为相关单位加强防护设备, 相关人员自身提高防护意识, 加强防护措施提供重要参考意见。

4 展望

微核实验用于化学致癌物的致畸致突变实验、电离辐射的生物剂量估算、化疗药物细胞学损伤及预后的监测乃至食品、化妆品、环境监测等诸多方面得到了广泛的应用。另一方面, 随着科技的进步微核实验技术也将不断向纵深方向发展。近年来, 微核检测借助于迅猛发展的分子生物学技术, 已逐步发展成为能同时检测染色体分裂延迟、断裂、丢失、细胞分裂不平衡、基因扩增、不分离、HPrt基因突变、凋亡以及DNA损伤修复障碍等多种遗传学终点的检测, 从而大大拓展丰富了微核试验的概念和应用范围^[6]。随着微核实验应用进一步发展拓宽, 新微核实验正向我们走来。在未来, 微核实验配合更多的先进技术如FISH技术、图象分析技术等等, 使得一个实验多个遗传损害终点的检测成为现实, 这将有利于整合优化各种试验技术和方法, 同时也对我国的实验室条件和研究水平提出了更高的要求。