骨肉瘤好发于股骨远端和胫骨近端等血运丰富的长骨干骺端, 是威胁儿童和青少年生命的最常见的原发性恶性骨肿瘤, 传统的治疗方法很难从根本上治愈骨肉瘤, 因为仍有很大一部分患者在治疗后呈现局部复发或远处转移^[1-3]。因此确定和筛选预测骨肉瘤的肿瘤标记物具有十分重要的意义。

MicroRNA (miRNA)与mRNA不完全互补配对, 从而发挥靶向调控的功能。所以miRNA的错误表达会导致大量的蛋白质错误表达^[4]。大量实验已经表明miRNA的异常表达与恶性肿瘤密切相关, 也可以作为某些肿瘤标志物存在^[5-8]。本研究初步探索miR- 199b-5p在骨肉瘤中的潜在性预测作用。

1 材料与方法 1.1 肿瘤组织的来源

选择2011年10月到2013年4月在中日联谊医院的30例骨肉瘤患者。骨肉瘤病例选取标准:①临床影像学及其活组织检查证实; ②无一例在手术前接受化疗和放疗。切除肿瘤和癌旁组织后, 快速置于液氮中保存。所有的组织和病理报告均真实可靠, 患者皆知情同意。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。RNA提取所需试剂TRLzol reagent和琼脂糖购自Invitrogen (美国)公司。SYBR Premix Ex TaqⅡ、qPCR逆转录、引物、SYBR^®PrimeScript^® miR- NA RT-PCR Kit (Perfect Real Time)试剂盒购自TAKARA大连宝生物公司。

1.3 RNA的提取及逆转录

按照TRLzol reagent (Invitrogen)说明书进行RNA抽提操作, 紫外分光光度计测定A₂₆₀/A₂₈₀比值, 并计算纯度及浓度, 取5 μg RNA用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 检测RNA的完整性。纯度、浓度和完整性均合格的RNA进行逆转录, 使用TAKARA试剂盒进行逆转录和qRT-PCR。

1.4 miRNA靶基因生物信息学预测

使用PicTar、TargetScanHuman 5.1及DIANA LAB 3个靶基因预测网站, 预测miRNA-199b-5p的靶基因, 结果以2个及其以上网站预测出的靶基因为有效靶基因。

1.5 qRT-PCR验证差异表达miRNA和基因

将500ng RNA加入20ul逆转录反应体系进行逆转录, RT -PCR仪对差异表达miRNA及靶基因进行验证, U6 snRNA作为内参, hsa-miR-199b-5p引物序列为: CCCAGUGUUUAGACUAUCUGUUC。扩增条件:95℃预变性30 s, 95℃变性20 s, 60℃退火延伸30 s, 45个循环。DRAM引物序列:5'-TTGTTTCTCCCTGCTCAT -3'和5'-TTCCTGCTCTTCACCTTT-3'。GAPDH引物序列:5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'和5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3';扩增条件:95℃预变性30 s, 95℃变性20 s, 60℃退火延伸20 s, 45个循环。

1.6 统计学分析

使用SPSS17.0统计软件进行统计学处理。待测样品值=2^-ΔΔct, 其中ΔΔct=Δct样品-Δct基准=(ct样品x-ct样品β-actin)-(ct基准x-ct基准β-actin)。两组计量资料采用非独立样本t检验, 多组计量资料采用方差分析, 检验水准以P < 0.05为差异具有统计学意义。用Origin8.0软件绘制图形。

2 结果 2.1 miR-199b-5p扩增曲线

显示为特异性扩增, 扩增曲线圆滑。融解曲线显示为单峰型曲线, 特异性较好。本实验结果可信(如图 1)。

2.2 miR-199b-5p在骨肉瘤组织和癌旁组织中的表达

RT-PCR方法检测了30例骨肉瘤组织和正常骨组织中miR-199b-5p的表达水平, 结果发现miR -199b-5p在所有组织中均有表达, 25例骨肉瘤组织中的miR-199b-5p的表达水平显著高于癌旁组织(如图 2, P < 0.01)。

2.3 miR-199b-5p在骨肉瘤中的表达与病理指标的关系

根据miR-199b-5p表达水平的中位值, 患者被分为低表达组和高表达组, miR-199b-5p与患者的性别、发病年龄、病变部位、肿瘤分型和分期无明显关系(如表 1, P > 0.05)。

2.4 DRAM mRNA在骨肉瘤组织和癌旁骨组织中的表达水平

RT-PCR法检测10例原发骨肉瘤组织和癌旁正常骨组织。结果发现, DRAM mRNA表达水平在癌旁骨组织中与骨肉瘤组织中没有显著差异(如图 3, P > 0.05)。

2.5 Spearman双变量相关性分析

DRAM蛋白在10例原发骨肉瘤组织及癌旁组织中的表达与miR- 199b-5p的关系(如图 4), 结果表明两者呈具有显著的负相关关系(r=-0.979, P < 0.05)。

3 讨论

MiRNA在不同肿瘤组织中的表达水平具有明显的特异性, 尤其是在恶性肿瘤中(如肝癌、胃癌和结直肠癌), miRNA在正常组织和配对的癌旁组织中表达亦显著不同^{[9, 10]}。Takamizawa^[11]等发现let-7在肺癌中表达降低与患者术后生存期缩短有显著联系, 而与疾病的分期无关。

众多文献报道表明miRNA参与肿瘤的发生、发展和远处转移。Hurst等^[12]研究发现, 转染miR- 146a或miR-146b后肺转移灶数目明显减少。本研究中我们发现miR-199b-5p在骨肉瘤组织中表达显著升高, 提示miR-199b-5p可以作为骨肉瘤诊断标志物, 而DRAM可能是miR-199b-5p的下游调控靶基因。