彗星分析是在单细胞水平上检测有核细胞DNA断裂的新技术, 广泛应用于遗传学、辐射生物学、毒理学、环境生态学等^{[1, 2]}。对于辐射所致DNA损伤的研究, 彗星分析技术较其它传统生物学技术有多种优势。从单细胞水平上检测DNA原发损伤。适用范围广:可检测多种类型的组织细胞, 而且对T和B淋巴细胞均敏感。简便、经济、快速:所需样品数量少(< 0.2 ml血样), 无需放射性核素, 检测时间短, 步骤简单, 花费甚少。敏感性高:可检测到0.05 Gy的低水平辐射, 比传统生物剂量学技术具有更高的敏感性^[3]。目前, 我国对放射工作人员的健康监护也日益重视, 防护体系也逐渐吸取了ICRP建议书中的许多经验。有文献报道^{[4, 5]}, 对于放射工作人员DNA损伤的评价, 彗星分析的敏感性高, 速度更快。本研究采用碱性彗星分析检测放射工作人员外周血淋巴细胞DNA单链断裂, 为单细胞凝胶电泳(SCGE)技术用于放射工作人员健康监测提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要试剂和仪器

正常熔点琼脂糖和低熔点琼脂糖美国Promega公司产品, Tris-HCl、DMSO和TritonX-100均为美国Sigma公司产品。水平电泳仪为美国BIO-RAD公司产品, ¹³⁷Cs γ辐射源购自加拿大原子能有限公司, 图像采集使用日本产Nikon 90i荧光显微镜和图像采集系统。

1.2 受试者选择

放射组为天津市某两家三甲医院从事医用X射线诊断, 心导管介入, 放射治疗工作人员共105例, 其中男62例, 女43例, 年龄23~56岁, 放射工龄1~30 a。为了分析不同工种之间的区别, 将放射组按照工种分为放疗组、介入组和放射科组。放射组个人剂量计监测年均当量剂量低于50 mSv。对照组来自上述两家医院的非放射工作人员96例, 男51例, 女45例, 年龄22~61岁, 近期无射线接触史及化学与工业毒物接触史。每名受试者均抽取外周血0.5 ml, 肝素抗凝, 进行彗星分析, 每份样品均重复实验1次。

1.3 淋巴细胞分离

血样加在等体积淋巴细胞分离液面上, 3 500 r/min离心2 min, 吸取中间层淋巴细胞, 置于2 ml离心管中, 加PBS至2 ml, 1 500 r/min离心6 min, 弃上清。重复洗涤2次, 再将淋巴细胞悬于PBS, 调整细胞密度为2 × 10⁴/ml, 置4 ℃冰箱备用。

1.4 碱性彗星分析实验

参考刘强等^[2]的方法。铺胶:取100 μl正常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于自制微电泳槽内, 置4℃冰箱固化, 25 μl淋巴细胞悬液与75 μl低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第一层凝胶上面, 置于4℃冰箱固化; 裂解和电泳:胶板置于新鲜配制的碱性裂解液, 4 ℃冰箱中裂解1.5 h; 用双蒸水漂洗去掉多余的盐分, 置于4 ℃电泳液中静置20 min, 然后在20 V, 200 mA电泳条件下电泳20 min; 染色和观察:溴化乙锭(EB)染色, 荧光显微镜下观察彗星, 图像采集系统随机摄取彗星图像, 每个剂量点拍摄50个彗星图像。

1.5 彗星图像分析统计学处理

彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫(University of Wroclaw)大学提供的CASP^[5]系统自动分析, 分析结果用SPSS13.0统计软件直接读取。选取彗星尾部DNA百分含量(TDNA%)、彗星尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)作为分析指标。用SPSS 13.0统计软件对上述指标进行单因素方差分析和组间两两对比。

2 结果 2.1 放射组与对照组DNA单链断裂水平

各组彗星分析指标见表 1, 2次实验结果差异无统计学意义, 因此合并数据进行分析。由表 1可见, 对照组与放射组的彗星分析各指标差异有统计学意义(F = 5.26, P < 0.01)。

2.2 不同工龄放射工作人员DNA单链断裂水平

不同工龄组放射工作人员彗星分析各指标比较见表 2, 由表 2可见, 不同工龄组的放射工作人员DNA损伤程度均高于对照组(F = 2.67, P < 0.05), 工龄大于20 a的放射工作人员, TDNA%, TL, TM和OTM均明显高于 < 10 a工龄组。

2.3 不同工种放射工作人员彗星分析各指标的比较

由表 3可见, 各个不同工种的放射工作者DNA单链断裂各项指标均明显高于对照组, 介入组的TDNA%、TL、TM和OTM最高, 放射科组次之, 放疗组最低。

3 讨论

电离辐射等各种外界因子诱发细胞DNA断裂时, DNA的超螺旋结构被破坏, 在裂解液的作用下, 细胞膜和核膜等膜结构受到破坏, 细胞内的蛋白质和RNA等其他成分扩散到裂解液中, 而核DNA由于分子量太大只能留在原位, 在碱性条件下, DNA发生解螺旋, 受损的DNA断链和片段被释放出来, 由于这些DNA的分子量很小, 所以在电泳过程中离开核DNA向阳极迁移, 荧光染色后受损部分形成彗星状图像, 故称"彗星分析"。彗尾的长短因DNA片断的大小而不同。目前, SCGE分析的主要指标包括形状指标(彗星细胞率)、距离指标(尾长、彗星全长)、强度指标(头DNA含量、尾DNA含量)和矩类指标(尾矩、Olive尾矩)等。本研究结果说明, 放射工作人员外周血淋巴细胞的DNA损伤程度明显高于对照组, 说明小剂量长期慢性照射对职业人群具有一定的辐射损伤作用, 这与对放射工作人员细胞遗传学检测的结果相一致^[6]。

本研究发现, 不同放射工种之间DNA损伤程度存在差异, 从事介入的医生最高, 放射科医生次之, 放疗科最低。只要心脏介入医生超过基本工作量(5例冠状动脉成形术), 接受的辐射水平将超过职业暴露的最低标准。可见, 心脏介入医生在手术过程中接受的辐射剂量较大^[7], 因此, 心脏介入医生的防护措施和防护意识应进一步加强。另外, 随着工龄的增加, 放射组的DNA损伤程度增加, 提示DNA损伤与工龄之间存在依赖关系。分析其原因, 在同等暴露条件下, 随着工龄的延长, 受照累积剂量增加, 辐射的累积效应导致DNA断裂增多, 造成DNA损伤水平的升高^[8]。

综上所述, 碱性彗星分析在检测DNA单链断裂中具有较高的灵敏度, 可以检测慢性职业暴露造成的人员DNA断裂, 在本研究中选取的受试者中, 其DNA损伤程度与放射工龄成正相关, 不同工种之间DNA损伤水平也存在差异, 说明碱性彗星分析在放射工作人员DNA损伤评价中具有一定的实用价值。