天然乳品中的成分——乳铁蛋白是一种非血红素铁结合性糖蛋白, 具有广泛的生物学活性, 目前虽对其确切的功能仍物定论, 但是很多研究已表明其与铁的代谢、抵抗病原菌、免疫调节、转录调节、抗肿瘤以及抗辐射损伤等有关。美国食品药品管理局早已允许乳铁蛋白作为食品添加剂用于运动、功能性食品。近年来, 国内外研究表明乳铁蛋白具有抗辐射损伤的作用^{[1, 2]}。本实验以X射线照射小鼠模型, 观察人乳铁蛋白对小鼠辐射损伤的影响, 以探讨其抗辐射作用。

1 材料 1.1 动物

balb/c小鼠168只, 6周龄, 清洁级, 体重20~22g, 雄性, 购于北京华阜康生物科技股份有限公司, 饲养于山东省医科院基础所实验动物中心, 室温21~26℃, 湿度60%~70%, 饮水和饲料均经过无菌消毒。

1.2 照射条件

采用西门子PRIUS医用电子直线加速器, 电压220V, 电流10mA。除正常组外, 其余两组均实施加速器X射线照射, 照射剂量为2Gy。于室温下照射小鼠。将小鼠固定于固定架上, 全身照射。

1.3 仪器与试剂

直线加速器(PRIMUS High Energy, 德国西门子公司); 双目显微镜(日本Olympus光学工业株式会社); 人乳铁蛋白(Human Lactoferrin, Sigma-Aldrich)。

2 方法 2.1 30d存活率 2.1.1 照前给药实验

小鼠42只随机分成3组, 即正常对照组、照射组、治疗组。用乳铁蛋白灌胃30d后, 除正常对照组外, 其余2组均实施加速器X射线照射, 照射剂量为6.8Gy。观察30d内各组小鼠一般情况以及生存率进行比较。

2.1.2 照后给药实验30d存活率

42只小鼠随机分成3组, 即正常对照组、单纯照射组、给药对照组。用6.8Gy X射线照射28只小鼠, 照射后立即向14只小鼠腹腔注射4mg乳铁蛋白的食盐水0.3ml。30d内观察各组小鼠一般情况, 一般生存状况进行比较。

2.2 小鼠骨髓辐射损伤防护实验

42只小鼠被随机分成3组, 即正常对照组、单纯照射组、给药组, 每组14只。连续灌胃乳铁蛋白7d, 1次/d。正常对照组和单纯照射组灌服生理盐水。给药第7天除正常对照组外其余组小鼠均接受2Gy X射线全身照射, 照射后继续给药3d。其中一批动物(每组14只, )取小鼠股骨, 用1ml胎牛血清冲出骨髓液, 在显微镜下做微核计数和有核细胞计数。另一批动物做有核细胞计数。另取42只小鼠随机分成3组, 即正常对照组、单纯照射组、给药组, 每组14只。除正常组外其余两组小鼠均接受2Gy X射线全身照射, 照射后腹腔注射乳铁蛋白3d。随后同上计数。

2.3 统计学分析

采用SPSS软件, 对30天的生存率进行χ²检验, 对两样本均数进行t检验。P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结果 3.1 小鼠30d生存率

照前和照后给予乳铁蛋白, 结果可见, 第8天给药组的存活率比单纯照射组提高55.3%, 62.5%, 平均存活时间与单纯照射组差异有统计学意义(P < 0.05)。其中照前给药组要比照后给药小鼠的30d存活率、平均存活天数高, 以及出现极期的时间要晚。X射线照射组小鼠3d开始死亡, 死亡主要发生在6~8d。照前给药组小鼠从8d开始出现死亡, 主要发生在14~16d。照后给药组小鼠12d出现死亡, 死亡主要发生在12~15d。见表 1。

3.2 对各组小鼠一般情况进行综合评分

每日观察并记录实验动物的活动情况、生长发育、毛色、摄食及排泄情况, 中毒症状、出现时间及死亡情况。照前和照后给予乳铁蛋白, 与正常对照组比较, 照射后2d各组小鼠, 出现经审查, 活动、饮食、饮水减少, 体重减轻, 毛发失去光泽、蓬松、易脱落, 耳廓及尾部苍白, 部分小鼠出现单眼或双眼失明现象, 以单纯照射组最为明显。单纯照射组的状态最差, 照前给药组和照后给药组状态要比照射组稍好。根据笔者观察, 照前给药要比照后给药组好些。

3.3 体重表现

每周记录一次体重, 体重比较, 照射组与给药组(包括照前和照后给药组)比较有统计学意义差异(P < 0. 01), 照前给药和照后给药组比较差异无统计学意义(P > 0.05), 见表 2。

3.4 小鼠骨髓辐射损伤防护结果

正常对照组、单纯照射组和给药组经过X射线全身照射或灌胃乳铁蛋白后, 观察乳铁戴白对受照小鼠骨髓有核细胞数及微核细胞率的影响。结果列于表 3。由表 3可以看出, 单纯照射组照后3d小鼠骨髓有核细胞数明显下降, 而乳铁蛋白给药组(包括照前和照后给药组)高于单纯照射组, 比较差异有统计学意义(P < 0.01)。单纯照射组照后3d小鼠骨髓的微核细胞率明显升高, 而乳铁蛋白给药组低于单纯照射组, 比较差异有统计学意义(P < 0.01)。

4 讨论

评价抗辐射药物最简单的方法就是观察实验动物辐照后30天的存活率及其生存状态。本实验中, 单纯照射组小鼠在照后8天存活率37.5%, 25天存活率0。而照前给药组、照后给药组照后8天的生存率92.5%, 100%, 25天28.5%, 28.5%, 这与单纯照射组比较存活时间差异存在统计学意义。说明, 乳铁蛋白无论是照前给药还是照后给药都具有较好的抗辐射作用。

X射线照射能够大大增大小鼠的死亡率^[3-5]。乳铁蛋白治疗组能够显著提高X射线照射的小鼠的生存率, 本研究还发现, 其中预照前给药组要比照后给药组小鼠的30d存活率、平均存活天数高, 以及出现极期的时间要晚。X射线照射组小鼠3d开始死亡, 死亡主要发生在6~8d。预防治疗组小鼠从8d开始出现死亡, 主要发生在14~16d。紧急治疗组小鼠12d出现死亡, 死亡主要发生在12~15d。受到同样的照射, 在同一时间点, 会发现照前给药组能够比照后给药组更加显著的提高生存率。

骨髓型急性放射病是以引起造血组织损伤为主^[6-8], 伴有其他系统改变的放射性疾病。骨髓中含有丰富的造血干细胞、祖细胞和各系统不同分化阶段的幼稚细胞, 对辐射具有高敏感性。小鼠受照后, 诱发有丝分裂需要的蛋白质合成受到抑制, 造成G2期阻滞, 导致有丝分裂数量下降^[8]。本实验中动物受到照射后, 骨髓有核细胞数降低, 但给药组会提高, 结果表明, 乳铁蛋白对照射后受损的骨髓具有一定的保护作用。

人体造血系统是具有较高辐射敏感性的组织之一, 而微核是辐射损伤的敏感指标。电离辐射诱发的淋巴细胞微核在一定剂量范围内与照射剂量相关, 大量的体内和体外实验结果已经充分证明这一点。小鼠受照后, 微核细胞数增加^[9], 但给药后微核数会降低, 结果表明, 乳铁蛋白对骨髓有一定的保护作用, 具有抗辐射损伤的功能。