中国辐射卫生  2012, Vol. 21 Issue (4): 385-386  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.04.078

引用本文 

刘瑞芳, 洪承皎, 李义杰, 张保国. 热休克预处理对X射线诱发淋巴细胞hprt基因突变的影响[J]. 中国辐射卫生, 2012, 21(4): 385-386. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.04.078.
LIU Rui-fang, HONG Cheng-jiao, LI Yi-jie, ZHANG Bao-guo. The Effects of Heat Shock Induction Expression of HSP70 on Hprt Genetic Mutation Induced by X-ray in Lymphocytes[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2012, 21(4): 385-386. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2012.04.078.

基金项目

国家自然科学基金(10275083)

通讯作者

张保国, E-mail:bgzhang@suda.edu.cn

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收稿日期：2012-05-27
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热休克预处理对X射线诱发淋巴细胞hprt基因突变的影响
刘瑞芳 , 洪承皎 , 李义杰 , 张保国     
苏州大学放射医学与防护学院  江苏省放射医学与防护重点实验, 江苏  苏州 215123
收稿日期：2012-05-27
基金项目：国家自然科学基金(10275083)
作者简介：刘瑞芳(1987~), 女, 山东聊城人, 在读硕士研究生, 研究方向:辐射防护.
通讯作者：张保国, E-mail:bgzhang@suda.edu.cn.
摘要：目的 探讨热休克预处理对X射线诱发淋巴细胞hprt基因突变的影响。方法 在42℃、5% CO2培养箱中对大鼠外周血淋巴细胞进行热休克处理90min。将细胞样本分为:对照组, 热休克组, 照射组, 热休克+照射组, 每组6个平行样本。每组样本再分成两组细胞, 其中一组细胞加入终浓度为0.1mmol/L的6-TG, 另一组不加6-TG。每组细胞经不同剂量(0.5Gy、1.0 Gy、1.5 Gy、2.0 Gy、2.5 Gy、3.0 Gy)X射线照射并恢复培养3h, 6h, 10h后, 用多核细胞法检测大鼠外周血淋巴细胞hprt基因突变。结果 大鼠外周血淋巴细胞接受不同剂量X射线照射后恢复3h, 6h, 10h, 热休克+照射组细胞hprt基因突变率与照射组细胞hprt基因突变率相比明显下降(P < 0.01)。结论 热休克预处理对X射线所致细胞hprt基因突变具有保护效应, 对X射线所致细胞hprt基因突变的保护作用在低剂量照射比高剂量照射时更为明显, 其保护效率与照射剂量之间为负相关系。
关键词：热休克预处理    X射线    hprt基因突变    
The Effects of Heat Shock Induction Expression of HSP70 on Hprt Genetic Mutation Induced by X-ray in Lymphocytes
LIU Rui-fang , HONG Cheng-jiao , LI Yi-jie , ZHANG Bao-guo     
School of Radiation Medicine and Protection, Medical College of Soochow University, Suzhou 215123 China
Corresponding author: ZHANG Bao-guo, E-mail:bgzhang@suda.edu.cn.
Abstract: Objective To explore the effects of heat shock pretreatment on hprt genetic mutation induced by X-ray in lymphocytes. Method The rat peripheral lymphocytes were cultured under 42℃ and 5% CO2 for 90min, then the cells were divided into 4 groups (control group, heat shock group, radiation group, heat shock + radiation group), each group including 6 parallel samples. And each group was fractionated into 2 parts, one part with 6-TG (final concentration was 0.1 mmol/L) and the other part without 6-TG. Each group of cells were irradiated by 0.5Gy、1.0 Gy、1.5 Gy、2.0 Gy、2.5 Gy、3.0 Gy X-ray and recovery cultured for 3h, 6h, 10h, and then polykaryocytes test was used to detect the hprt mutation in the rat peripheral lymphocytes. Results After exposure to different dose X-ray and recovery culture for 3h, 6h, 10h, the mutation rate of hprt in heat shock + radiation group was significantly decreased (P < 0.01) compared to radiation group. Conclusion Heat shock pretreatment has protection effects on hprt mutation induced by X-ray. HSP70 has more obvious protection effects in low dose radiation than high dose radiation on hprt mutation induced by X-ray (P < 0.01). There is negative correlation between protection effects and radiation doses.
Key words: Heat Shock Pretreatment    X-ray    Hprt Genetic Mutation    

热休克蛋白(heat shock proteins.HSPs)是一类保守的细胞内源性保护蛋白, 可以在许多不利的情况下被刺激表达, 它的生理作用就是保护细胞免受损害。平时热休克蛋白的表达量很低, 但是当细胞遇到环境因素刺激时, 它的变化主要表现在两个方面:第一, 表达量快速增加; 第二, 从细胞质进入细胞核和线粒体, 并与其中的蛋白质结合以防止刺激因素引起蛋白质的构象发生变化并帮助已发生变化的蛋白质恢复到正常状态, 从而发挥了保护细胞的作用。有很多方法可以诱导细胞细胞表达热休克蛋白, 热休克处理是最常用、最有效的方法。电离辐射广泛用于工农业、国防、医疗等领域, 因此对电离辐射所致生物学损伤日益受到关注。本文应用多核细胞法, 研究热休克预处理对X射线致细胞hprt基因突变的影响。为预防放射损伤提供依据及方法。

1 实验材料 1.1 细胞来源及细胞培养

雄性Wistar大鼠(苏州大学动物实验中心提供), 体重(130 ± 5) g。无菌环境下, 从大鼠腹主静脉采血, 应用Ficoll法[1]分离大鼠外周血淋巴细胞, 在含20%小牛血清、100μg/mL PHA、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI1640培养基中, 于38℃、5% CO2培养箱中培养[2]。

1.2 主要试剂和仪器

淋巴细胞分离液购自上海精华生物高科技有限公司; PHA购自广州市医药工业研究所; 吉姆萨(Gemisa)染料购自上海西塘生物科技有限公司; HAT (hypoxantin, aminopterin, thymidin), 6-巯基鸟嘌呤(6-TG), 细胞松弛素B (Cyt-B), 二甲基亚砜(DMSO)均购自Sigma公司。低速水平离心机(中佳KDC-40);倒置相差显微镜(Olympus CK41);医用高能直线加速器(SIEMENS PRIMUS)。

2 试验方法 2.1 细胞处理

热休克预处理:淋巴细胞于42℃、5% CO2培养箱中热处理90min, 然后取出置于38℃、5% CO2培养箱中, 恢复培养3h, 6h, 10h[3]。辐照处理:X射线照射实验使用医用高能直线加速器(SIEMENS PRIMUS), 照射能量为6MV, 剂量率为200cGy/min, 源轴距100cm。

2.2 细胞分组

将细胞样本分为:对照组, 热休克组, 照射组, 热休克+照射组, 每组6个平行样本。每组的平行样本再分成两组细胞, 其中一组细胞加入终浓度为0.1mmol/L的6-TG, 另一组不加6-TG。

2.3 多核细胞法检测hprt基因突变率

本实验采用多核细胞法[4]检测大鼠外周血淋巴细胞hprt基因突变。按对应分组条件处理完细胞样本后38℃、5% CO2培养箱培养30h, 加入终浓度为6μg/mL的Cyt-B, 72h终止培养; 加甲醇:冰醋酸(5:1) 2ml, 22℃室温静置10min, 进行3次固定; 然后在新配制的10%吉姆萨工作液(pH 7.0)中染色20min, 用蒸馏水冲洗残留吉姆萨工作液, 空气中自然干燥。

2.4 镜检分析方法

参照文献[5]的标准结合我们的经验, 双(多)核细胞的判断标准为:胞体比转化淋巴细胞大, 胞浆丰富, 胞核较大, 圆形或近圆形, 有2个或2个以上胞核, 染色较深, 核膜完整, 常见胞核重叠、相切或相离, 有时核形不规则。每个剂量点计数6 000个转化细胞(其中加与不加6-TG个计数3 000个)

2.5 hprt基因突变率和热休克预处理对X射线所致hprt基因突变的保护效率

hprt基因突变率定义为:含6-TG培养的1 000个转化细胞中双核或多核细胞数除以不含6-TG培养的1 000个转化细胞中双核或多核细胞数。

热休克预处理保护效率(%)=[(照射组hprt基因突变率-对照组hprt基因突变率)-(热休克+照射组hprt基因突变率-对照组hprt基因突变率)]/(照射组hprt基因突变率-对照组hprt基因突变率)× 100%。

2.6 统计方法

所有实验数据采用SAS8.0统计软件处理, 数值以x±s表示, 数据统计采用H检验和两因素析因设计方差分析; 图表由Origin7.5软件制作。

3 实验结果 3.1 42℃, 90min热休克处理对淋巴细胞hprt基因突变的影响

大鼠外周血淋巴细胞于42℃培养箱中热休克预处理90min, 发现热休克组hprt基因突变率(0.0485 ± 0.0080)与对照组hprt基因突变率(0.0472 ± 0.0072)比较无明显差异(P > 0.05)。提示在42℃条件下热休克预处理90min对大鼠外周血淋巴细胞hprt基因突变率没有影响。

3.2 热休克预处理对X射线致大鼠外周血淋巴细胞hprt基因突变的影响

大鼠外周血淋巴细胞接受不同剂量X射线照射后恢复3h, 6h, 10h, HSP70对细胞hprt基因的保护效率分别列于表 1, 表 2, 表 3。经两因素析因设计方差分析发现, 热休克+照射组细胞hprt基因突变率与照射组细胞hprt基因突变率相比明显下降(P < 0.01)。说明热休克预处理对X射线所致细胞hprt基因突变具有保护效应, 热休克预处理对X射线所致细胞hprt基因突变的保护作用在低剂量照射比高剂量照射时更为明显, 其保护效率与照射剂量之间为负相关关系。

表 1 热休克处理后恢复3h对外周血淋巴细胞hprt基因的保护效应(n=3)

表 2 热休克预处理后恢复6h对外周血淋巴细胞hprt基因的保护效应(n=3)

表 3 热休克处理后恢复10h对外周血淋巴细胞hprt基因的保护效应(n=3)
4 讨论

Hprt (hypoxanthine phosphor-ribosyl transferase gene)基因位于细胞X染色体上, 是细胞存活的非必需基因, 其表达产物是HPRT酶。HPRT酶可以催化次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸反应, 生成相应的核苷-5-单磷酸(NMP), 这是一条生成NMP的补充途径。如果存在毒性嘌呤类似物如6-巯基鸟嘌呤(6-TG)、6-巯基嘌呤(6-MP)等, 则以这些物质为底物可以生成相应的NMP, 参与DNA的合成导致细胞死亡。如果致突变剂(电离辐射)使hprt基因失活(hprt-), 将导致细胞中的HPRT酶活性大幅下降, 从而使(hprt-)细胞能够在含有一定浓度的毒性嘌呤类似物的选择性培养基中正常生长, 而这个浓度足以导致HPRT酶水平正常的细胞(hprt+)发生死亡。由此可以筛选出hprt基因突变细胞。籍此原理, 在培养体系中加入细胞松弛素B (Cyt-B)阻止细胞微丝聚集, 阻滞胞质分裂而核分裂不受影响, 以获得第一次分裂双核细胞的微核, 由此形成了多核细胞法检测hprt基因位点突变率。它克服了常规微核法无法区分细胞是第几次有丝分裂的缺点, 能更精确、快速、简便地衡量hprt基因的突变。

放疗是治疗肿瘤的主要方法之一, 但放疗在破坏肿瘤细胞的同时对正常细胞也会产生遗传损伤。hprt基因位点是一个对电离辐射比较敏感的位点, hprt基因突变分析系统是一种常用的分析和定量体细胞突变的方法, hprt突变率可以在基因水平上反应细胞遗传损伤的程度。已有的研究证实热休克蛋白对细胞电离辐射损伤具有保护效应:①热休克蛋白可以减少辐射诱导的细胞凋亡[6]; ②热休克蛋白可以减轻辐射引起的DNA损伤[7]。但如果受热休克蛋白保护的细胞不发生凋亡及DNA损伤, 而发生基因突变, 产生遗传性损伤, 这时HSP70的保护效应是实际意义不大, 只有既能保证细胞的存活又能使细胞的基因损伤得到修复的保护效应才具有真正的实际意义。国内外对热休克蛋白对细胞电离辐射损伤的保护效应主要集中在细胞凋亡和DNA损伤的研究, 对hprt基因突变的研究尚未见报道。我们的研究结果显示:对大鼠外周血淋巴细胞当照射剂量在0~3.0Gy时, 42℃, 90min热休克预处理后恢复3h, 6h或10h, 可以对X射线所致细胞hprt基因突变产生明显保护效应(P < 0.01), 其对细胞hprt基因突变的保护作用在小剂量照射时更加明显, 热休克处理对辐射所致hprt基因突变保护作用随辐射剂量而变化, 这种特性, 对于辐射防护领域所关心的小剂量照射人群的医学防护具有特殊意义。

目前关于热休克蛋白减少辐射引起hprt基因突变的机理还不清楚, 已有的研究表明:当细胞受到应激刺激时, 热休克蛋白表达增加并逐步向细胞核内聚集, 热休克蛋白通过"分子伴侣"作用, 促进损伤DNA的修复[8]。我们推测, 这可能与热休克蛋白能稳定染色体结构, 减轻DNA损伤的功能有关, 具体机理需要进行进一步的深入研究。

参考文献
[1]
杨吉成, 宋礼华, 周建华, 等. 医用细胞工程[M]. 上海: 上海交通大学出版社, 2001: 61-62.
[2]
徐永忠, 劳勤华, 赵经涌. 大鼠外周淋巴细胞HPRT基因突变检测的方法学探讨[J]. 苏州医学院学报, 1998, 18(1): 6-8.
[3]
李义杰, 洪承皎, 张保国. 热休克诱导表达的HSP70对X射线诱发淋巴细胞凋亡的影响[J]. 辐射研究与辐射工艺学报, 2009, 27(3): 156-160. DOI:10.3969/j.issn.1000-3436.2009.03.006
[4]
赵经涌, 崔凤梅, 劳勤华, 等. 多核细胞法和Brdurd法检测辐射诱发体细胞HPRT基因突变的比较研究[J]. 工业卫生与职业病, 2003, 29(2): 23-26.
[5]
金璀珍. 放射生物剂量估计[M]. 北京: 军事医学科学出版社, 2007: 48-49.
[6]
Gordon SA, Hoffman RA, Simmons RL, et al. Induction of heat shock protein 70 protects thymocytes against radiation-induced apoptosis[J]. Archives of surgery, 1997, 132(12): 1277-1282. DOI:10.1001/archsurg.1997.01430360023004
[7]
Bases Robert. Heat shock protein 70 enhanced deoxyribonucleic acid base excision repair in human leukemic cells after ionizing radiation[J]. Cell stress & chaperones, 2006, 11(3): 240-249.
[8]
Calini V, Urani C, Camatini M. Overexpression of HSP70 is induced by ionizing radiation in C3H10T1/2 cells and protects from DNA damage[J]. Toxicology in Vitro, 2003, 17: 561-566. DOI:10.1016/S0887-2333(03)00116-4