放射性皮炎是肿瘤放射治疗最常见的并发症, 约87%的放疗患者会出现红斑及其以上的放射性皮肤反应^[1], 其中湿性脱皮的发生率为10%~15%。另有资料显示, 乳腺癌患者中放疗结束时约10%会发生湿性脱皮^[2], 只有4%~8%的患者无明显皮肤反应。高能X射线的应用在一定程度上降低了严重皮肤反应的发生, 但是近几年来随着一些放疗新技术的开展, 如体位固定材料热塑膜的使用, 乳腺癌保乳术后切线野照射SIB-IMRT放疗技术的开展, 以及放化疗同步治疗的广泛应用, 放射性皮肤损伤的发生率又有提高的趋势。

1 放射性皮肤损伤的病变特点、规律和机制研究进展 1、1 射线的作用特点

引起放射性皮肤损伤的主要射线是X、β及γ射线。X、γ射线穿透能力强, 除皮肤外, 皮下组织, 甚至骨骼也受损, 有时产生溃疡长期不愈。β射线损伤浅, 在外照射时主要作用于皮肤, 因此皮肤损伤是其主要表现。此外, 不同射线产生相同皮肤损伤所需的吸收剂量不同。γ射线损伤皮肤吸收剂量大, β射线则较小。因为γ射线的穿透能力强, 电离作用小, 传给皮肤的能量也小, 部分能量消耗在深层组织。X射线作用与γ射线类似。而β射线的电离作用强, 皮肤吸收的能量也多。有相当一部分X或γ射线皮肤损伤合并有放射病, 使观察和治疗更为困难^[3]。

1、2 剂量-效应及反应时间的关系

皮肤是辐射中度敏感组织之一。Borak在1936年指出表皮致死量为20Gy, 大多数研究认为, 如果皮肤吸收总剂量超过30Gy将发生溃疡。Hopewell报道, 辐射后皮肤发生反应及开始的时间:①干燥脱皮3~6周; ②溃疡4~6周; ③反复溃疡> 6周; ④真皮坏死> 10周; ⑤真皮萎缩> 6周; ⑥毛细血管扩张> 52周; ⑦浸润纤维化与愈合方式、急性溃疡、复发溃疡和真皮坏死导致的瘢痕组织形成有关; ⑧急性溃疡 < 14d⑨急性表皮坏死 < 10d。

1.3 病理形态改变

Teloh (1950年)首先对放射性皮肤损伤组织学改变做了较详细的描述, 将皮肤效应分为早期的(开始照射后0~6个月)和晚期的(6个月以后)。早期变化分为4度:Ⅰ度为毛囊性丘疹与脱毛; Ⅱ度为可复发性病变的红斑反应, 并出现皮肤色素沉着; Ⅲ度为水疱形成, 愈后留下斑痕和色素沉着; Ⅳ度反应为坏死溃疡, 该溃疡可恶变。病程分初期反应期、潜伏期(假愈期)、基本反应期(症状明显期)和恢复期。晚期变化亦分4度:Ⅰ度为萎缩性皮炎或增生性皮炎; Ⅱ度为皮肤皮下组织放射性纤维化; Ⅲ度为晚期放射性溃疡; Ⅳ度为放射性肿瘤。晚期变化是显著的:上皮萎缩或增生, 角化过度或角化不全; 真皮内弹力纤维有些人认为是减少的, 而另一些人认为数量可能增多, 存在于真皮上部、真皮部以及皮下组织, 分布杂乱无章。胶原纤维呈大量增生或玻璃样变, 毛囊、皮脂腺缺乏, 少部分汗腺残存。成纤维细胞大而不规则, 嗜碱性, 浓染胞核, 有些学者认为这些细胞是对照射特异的或是具有诊断意义。

1.4 放射性皮肤损伤的机制 1.4.1 细胞生物学机制

皮肤放射性损伤的机制, 主要是上皮的发生层细胞和皮下血管的变化。首先见到在照射部位毛细血管反射性扩张, 局部形成充血性反应, 出现红斑, 并在皮肤溃疡形成之前, 就可以发生血管损伤和微循环障碍。而引起伤口愈合不良的原因是进行性的微血管阻塞, 上皮细胞以及成纤维细胞增生不良。通过电镜可以观察到^[4], 放射性皮肤损伤初期, 组织细胞变性坏死, 广泛纤维化。表现在内皮细胞增生肿胀, 管壁增厚, 官腔变窄、闭塞, 甚至内皮细胞变性, 胞浆中大量空泡形成, 细胞间隙增宽, 基底膜局部断裂。受照后短期内出现皮肤不同程度的坏死, 形成急性放射性皮肤损伤。人慢性放射性皮肤溃疡电镜下显示, 真皮内层纤维、细胞核轻度固缩, 胶原纤维变性, 部分细胞核溶解, 透明角质颗粒破碎, 电子密度增大, 间质内出现大量空泡, 表皮棘状细胞部分细胞桥粒断裂, 间隙扩大。线粒体轻度肿胀, 嵴断裂, 有的形成空泡, 胞浆内可见密集的黑素颗粒。上述变化可以导致受照部位组织供血不足, 使物质交换受限。

1、4、2 分子生物学机制

放射线主要是通过导致DNA双链断裂(DNA double..strand break, DSB)起到杀死肿瘤细胞的作用。但细胞有较高程度的DSB修复能力, 修复方法有两种:以DNA依赖蛋白(DNA..dependent protein kinase, DNA..PK, 包括Ku80/Ku70异二聚体和DNA-PK催化亚单位DNA.. PKCs)为主的非同源性末端连接(DNA nonhomologous end- joining, NHEJ)和以ATM (ataxia..telangiectasia mutated)为主的同源重组(homologous recombination)修复。尤以NHEJ为著。在此过程中, Ku70和Ku80蛋白首先形成稳定的复合体, 再与DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA..PKcs)结合成DNA依赖性蛋白激酶以识别和结合损伤的DNA末端, 启动相应的信号转导和DNA修复反应。大量研究表明, Ku70蛋白不仅在DSBs的修复中至关重要, 而且在DNA复制、基因转录调控和端粒结构的维持等多种细胞活动中发挥着重要作用, 且在细胞由于离子辐射引起的DSB和其它生理氧化反应, V (D) J重排及药物造成的相似损伤的修复中同样起着重要的作用。因此, 以Ku蛋白为靶点提高肿瘤细胞的放射敏感性日益受到肿瘤学家们的重视。近年来, Ku还在肿瘤预后、发生发展、诊断和治疗等研究中已经开始受到重视^[5-7]。

2 影响因素 2.1 内在因素

内在因素包括患者的皮肤特点、照射部位、营养状况、年龄、一般情况以及种族等。通常机体潮湿的部位及皮肤皱褶的部位较易出现皮肤反应, 例如头颈部、乳腺下、腋窝、会阴部和腹股沟等部位。营养状态可影响伤口的愈合。此外表面涂抹有香味的油脂或含有金属元素的物质如汞或银等, 常可加重皮肤的反应。Porock等对放射反应的预测因子进行了研究, 126例乳腺癌患者接受术后放疗, 全乳腺45Gy而后局部电子线补量20Gy, 根据RTOG的标准每周进行评估。绝大多数出现了Ⅰ反应, 第5周结束时, 约25%~50%的患者出现了鲜亮红斑或湿性脱皮, 部位主要集中在腋窝、乳腺下及胸骨处。单因素对数回归分析表明, 许多变量与严重的皮肤反应有关(指Ⅱ度以上):①肥胖, 与反应程度正相关; ②吸烟, 吸烟的患者放疗中细胞的再氧化能力降低, 且尼古丁本身可引起表皮血管的收缩, 从而影响伤口的愈合; ③肿瘤分期, 肿瘤越大, 手术对周围组织损伤越大, 伤口愈合越困难; ④年龄, 年龄与反应程度呈负相关, 原因可能与年龄大的患者接受化疗较少有关。尽管Porock的研究结果需要进一步的证实, 但是可为我们的临床工作提供参考。

2.2 外在因素

外在因素包括放射线能量、放疗剂量及分割方式等均对放射性皮肤反应程度有影响。尽管现代直线加速器的皮肤防护效应能使最大剂量点落在皮肤基底细胞层以下, 但有些照射技术可能会增加皮肤的受照剂量, 比如皮肤填充物的应用, 热塑膜的使用, 平行对穿照射而两侧皮肤靠近者(如喉癌放疗), 应用电子线照射, 乳腺癌保留乳房术后SIB-IMRT放疗技术的开展等。而且, 在放疗后辅助化疗的患者常常可观察到一种记忆现象, 表现为患者在放疗结束一段时间后行化疗, 原放疗部位可出现红斑及瘙痒等放射性的皮肤反应, 其发生的原因目前还不清楚, 但有一些假说, 比如照射野干细胞的衰竭、存活干细胞的基因变异、放疗局部血管的改变以及药物超敏反应等。许多化疗药物可引起记忆效应, 如更生霉素、多柔比星、甲氨蝶呤、氟尿嘧啶和博来霉素等, 近年来的一些新药如吉西他滨、紫杉醇和培美曲塞也发现有记忆效应^[8]。记忆效应存在的时间从数周到数年不等, 有患者放疗25年后化疗还可出现放射性皮炎。杨华等^[9]观察发现, 糖代谢紊乱与鼻咽癌患者放射性皮炎显著相关。①合并糖代谢紊乱患者和单纯鼻咽癌患者3度以上放射性皮炎的发生率高; ②空腹血糖、餐后2h血糖水平与放射性皮炎程度呈正相关; ③合并糖代谢紊乱患者放射性皮炎的平均愈合时间较单纯鼻咽癌延长。因此急性放射性皮炎的轻重与单次照射剂量、分割方法、总剂量、射线种类、受照射体积、照射技术、射线能量、剂量分布及年龄、吸烟史、血糖水平增高、同期放化疗等多种因素有关。

3 放射性皮炎的评价

1992年RTOG毒性标准的简写版正式发行, 包括急性放射损伤分级方案、SOMA分级, 并不完善, RTOG急性放射性皮炎损伤分级标准共有5级^[10]:0级:基本无变化; Ⅰ级:水泡, 淡红斑, 毛发脱落, 干性脱皮, 出汗减少; Ⅱ级:皮肤触疼, 明显红斑, 和片状湿性脱皮, 中度水肿; Ⅲ级:除皮肤皱褶处之外的融合性湿性脱皮, 重度水肿; Ⅳ级:溃疡, 出血, 坏死。RTOG毒性标准至今仍被临床使用, 被认为是评价放射性皮肤反应最有临床使用价值的方法, 但它的局限在于把干性脱皮和轻微红斑和片状湿疹脱皮等同起来, 而患者认为其间是有差别的, 并且没有包括患者的主诉。而由Nole Adams提出的RISRAS分级标准则考虑到了这个问题, 它包含了患者的主观感受和医生的专业评估, 因此结论更为全面和准确。但由于它缺少客观的指标, 因而也受到一些批评。近些年, 出现了一些针对放射性皮肤反应的客观评价方法。用分光光度法测定反射系数的方法曾在皮肤病学诊断中应用了许多年, 现在成为评价受照射皮肤红斑程度的可靠方法。该方法利用放疗中表皮细胞的死亡将导致血流减慢的原理, 将探针接触患者肤几秒钟, 通过测定皮肤微循环的血容量来评价红斑的程度。不同照射区域的皮肤红斑程度都可测量, 还可通过测量周围的正常皮肤进行对照。该仪器还能探测到亚临床红斑, 较肉眼观察敏感的多。有研究证实, 应用分光光度法可测到在放疗低剂量就出现的肉眼不易察觉的红斑, 从而解释了为什么在放疗早期有些患者就出现放疗相关的不适^[11]。另外, 放射损伤可导致皮肤内自由水分子与结合水分子的改变, 而电容率的大小与皮肤组织中水的含量有关。因此可以通过测定电容率来评价放射损伤的程度^[12]。其他的还有超声探测技术等。尽管这些技术可提供重要的客观资料, 但用于临床实践还需要进一步的研究。

4 放射性皮肤反应的临床表现 4.1 放射性皮肤损伤的分类

放射性皮肤的损伤, 又可分为急性放射性皮肤损伤和慢性放射性皮肤损伤。

4.2 临床表现 4.2.1 急性放射性皮肤损伤的临床表现

急性放射性皮肤损伤, 一般分为4期, 即初期反应期、潜伏期、基本反应期及恢复期。①初期反应期:患者的皮肤、黏膜没有发现明显的皮肤粗糙、毛囊丘疹、红斑等改变。②潜伏期:Ⅰ度皮肤损伤10~65 d, 平均28d。Ⅱ度皮肤损伤8~34d, 平均21 d。③基本反应期:最初皮肤有胀感、瘙痒, 后皮肤粗糙, 或出现散在粟粒大小毛囊丘疹。或初期为斑点, 斑片状红斑, 逐渐扩大融合色泽加深呈暗紫色, 压之不退色。红斑后7~16d出现性质不同的水疱, 破溃后局部表浅糜烂或形成溃疡。④恢复期:进入恢复期以后, Ⅰ度皮肤损伤开始脱屑, 色素沉着, 无明显自觉症状。浅Ⅱ度疮面脱痂后, 色素沉着, 无斑痕形成。深Ⅱ度愈合后色素脱失, 形成花斑状。

4.2.2 慢性放射性皮肤损伤的临床表现

临床表现可分为慢性放射性皮炎、硬结性水肿、慢性放射性溃疡及放射性皮肤癌4种类型, 其中以放射性皮炎最为常见。皮炎表现为皮肤萎缩, 腺体和毛囊均萎缩或消失, 皮肤干燥、失去弹性, 色素沉着与色素脱失相间并存, 表皮变薄、浅表毛细血管扩张, 脱屑, 皮肤瘙痒。硬结水肿表现为局部皮肤水肿变厚, 表面如橘皮状, 触之其坚如板。水肿波及皮下组织极易破溃。放射性溃疡创面污秽苍白, 有不同程度的感染, 溃疡四周呈放射性皮炎表现。放射性皮肤癌在临床上也不少见, 以鳞状上皮细胞癌和基底细胞癌为主, 也有在慢性皮炎基础上发生肉瘤、黑素瘤和皮脂腺癌的报道。随着癌瘤放射治愈率的提高, 癌症患者生存年龄的延长, 放射性损伤组织癌变发生率可能将会增加^[13]。

5 皮肤放射性皮炎的预防和治疗

鉴于慢性放射性皮肤损伤具有潜在性、进行性以及反复性损伤的特征, 溃疡后所致的坏死溃疡, 颇为难治。因此放射治疗过程中注意放射剂量的个体化以及放疗方案的选择, 同时加强辐射防护及对放疗患者的皮肤保护, 尤为重要。为了控制、改善或防止远期放射生物效应, 许多学者都在努力寻找预防和治疗放射性皮肤损伤的药物。

5.1 植物提取物

芦荟凝胶芦荟是国内外研究较多的放射性皮肤防护的物质。芦荟属百合科植物, 芦荟中含有多种化学成分, 能渗透到皮肤深处, 维持皮肤pH值的平衡, 促进胶原的合成和细胞的再生。芦荟汁中的氨基酸及活性酶, 对改善免疫功能, 增加白介素, 清除自由基等具有重要作用。其多糖成分, 如甘露聚糖肽具有抗菌、抗病毒的作用, 并能抑制白细胞黏着和促进血管再通, 从而促进伤口的愈合。动物实验显示, 芦荟提取物可提高受照射小鼠的存活率, 对受8、5Gy射线照射的小鼠有明显的抗辐射损伤作用^[14]。另外一个包含70例患者的随机对照双盲研究^[15], 应用与上述相同的评价标准, 治疗组应用芦荟和温和的肥皂, 对照组只应用温和的肥皂, 发现芦荟可以延缓放疗反应出现的时间及降低严重程度(P=0.013)。

5.2 植物油类

有研究表明, 放疗中保持皮肤湿润可以减轻放射性皮肤反应。植物油中含有多种必需脂肪酸(EFAs), 在保持皮肤湿润的同时, 还可以为细胞修复提供能量^[16]。而且其中的γ-亚麻酸(GLA)可产生前列腺素, 具有抗感染和保护血管的作用。玫瑰油、橄榄油因为其高的脂肪酸含量, 被认为具有修复疤痕、抑制收缩及促进创口愈合的作用, 常常被推荐用于皮肤防护。夜来香油含有的高浓度的亚油酸和亚麻酸, 可减轻过敏性皮炎, 但尚无证据证明其对放射性皮炎的作用。另外, 杏仁油曾被一家瑞士研究所常规用做放射治疗中皮肤防护长达10年之久。

5.3 乳膏类

激素类乳膏, 如1%氢化考的松乳膏可能对缓解局部的干燥和瘙痒有一定的作用, Shukla等^[17]研究发现局部应用倍氯米松喷雾剂, 可以减轻乳腺癌术后放疗患者皮肤湿性脱皮的发生率。但激素可以使皮肤变薄, 长期应用具有依赖性, 且可能掩盖表面的感染, 因此使用应谨慎。

比亚芬是一种复合制剂, 含有二醇单硬脂酸酯、硬脂酸、十六酸十六酯、固体石蜡等多种活性成分。具有深部水合作用, 可减轻照射皮肤的干燥, 提高患者的舒适感。可改善微循环, 增加皮肤血流速度, 还可改变白介素Ⅰ、Ⅵ之间的比例, 有利于减轻炎症反应, 对豚鼠的研究显示, 本品可加快皮肤的微循环速度, 2h潜伏期后, 血流在2h内增加25%, 24h内增加50%, 因此可以提高皮肤的耐受性。另外, 还可刺激成纤维细胞增生, 增加胶原的合成。Szumacher等^[18]的Ⅱ期临床研究表明, 60例放化疗联合的乳腺癌患者应用比亚芬, 放射性皮肤反应的发生率为低于Ⅱ级者15%, Ⅱ级83%, Ⅲ级2%, Ⅳ级0。且比亚芬组发生Ⅱ级急性放射性皮炎的中位时间为25 d, 明显晚于对照组18 d。另外, 比亚芬在改善血液循环的同时, 能增加损伤部位巨噬细胞的数量, 巨噬细胞可吞噬阻碍损伤皮肤愈合的细菌、坏死碎片、渗出物等, 从而有利于损伤组织的愈合。

5.4 重组人表皮生长因子

细胞分子生物学研究表明, 皮肤创伤的愈合受多种肽类生长因子的调控, 其中倍受关注的是表皮生长因子。通过与基底层细胞的表皮生长因子受体(EGFR)结合发挥其生物作用。能促进鳞状上皮、血管内皮等多种细胞生长, 调节蛋白合成, 促进新生肉芽组织的形成和伤口的再上皮化, 从而加速创面愈合。李素艳^[19]应用rhEGF对40例头颈部肿瘤放疗患者进行研究, 用药组和对照组Ⅲ、Ⅳ级放射性皮炎的发生率分别为95%和50%, P=0.005, 且Ⅲ级放射性皮炎的愈合时间≤ 3 d者, 用药组3/7, 而对照组0/14。因此认为rhEGF可降低Ⅲ、Ⅳ级放射性皮炎的发生率, 并缩短Ⅲ级皮炎的愈合时间。

5.5 中药类 5.5.1 中药提取物 5.5.1.1 茶多酚

电离辐射作用机体后, 使其内环境的水分子电离和激发而产生水化电子(Eaq)和羟自由基(·OH)等活性产物, 有氧存在时Eaq和·OH会演变成寿命较长的超氧阴离子自由基(·O₂), 是辐射损伤的主要原因。因此通过清除皮肤和黏膜组织中的超氧阴离子自由基可以减轻或避免放疗引起的皮肤黏膜损伤^{[20, 21]}。茶多酚因易被氧化成为醌类而提供质子H⁺, 具有显著的抗氧化特点, 使其能够有效清除体内的有害自由基, 可诱导动物免疫系统的多种细胞因子的合成, 具有抗氧化和抗肿瘤等多种药理作用。

5.5.1.2 黄芩苷

具有抗氧化、抗炎、抗菌、抗病毒和抗肿瘤等多种药理作用。实验表明放射性皮炎和简单皮肤切口损伤不同, 创面组织EGF呈弱表达, 愈合缓慢, 薛俐等^[22]复方茶多酚软膏可促进急性放射性皮炎创面组织EGF的合成和分泌, 有效减轻皮肤放射性损伤程度, 加快伤口的愈合。实验过程还发现, 复方茶多酚软膏还可以提高皮肤黏膜的辐射损伤耐受剂量, 明显降低放射性皮肤损伤的发生率。减轻皮肤黏膜放射损伤的严重程度, 使放射性皮肤损伤的发生时间延缓。

5.5.2 水剂

黄芩黄柏黄连均为清热解毒的要药, 黄芩苦寒入肺经, 善清肺经热邪, 兼有解毒功效; 黄柏善清热疗疮, 且坚因阴燥湿; 黄连具有清热解毒、止痛、生肌之功效。王文玉等将107例接受放疗的患者随机分为实验组(放疗期间放射野外涂三黄液, 其主要成分为黄芩、黄柏、黄连)55例和对照组(未做任何处理)52例, 实验组Ⅱ度以上放射性皮炎发生率明显低于对照组, 有显著性差异(P < 0、01), 产生Ⅱ度以上放射性皮炎射线剂量的实验组71、4%发生于40Gy以上, 而对照组72、1%发生于40Gy以下, 有显著性差异(P < 0、05)。结论:三黄液能延缓放射性皮炎的发生, 并对避免Ⅱ°以上放射性皮炎的发生有较好的效果^[23]。

5.5.3 膏剂

王友军等将66例接受放疗的并发症Ⅱ°-Ⅲ°放射性皮炎的患者随机分为湿润烧伤膏治疗组(36)例与对照组(30)例, 观察疼痛减轻的程度和创面愈合的情况。结果无论是疼痛减轻程度还是创面愈合的情况, 治疗组都明显优于对照组, 具有统计学意义^[24]。祖国红等用白玉防护膏(当归、白鲜皮、苦参、紫草、白芷、血竭冰片、甘草及氯霉素等), 对Ⅰ、Ⅱ级放射性皮损中位愈合时间为(5 d, 11d), 该防护剂减轻了放疗后皮肤痒感、紧绷、疼痛等不适有明显作用, 对预防红斑及干性脱皮较显著, 对小片湿性脱皮水疱有阻止发展并治疗作用, 并有延缓推迟皮肤湿性脱皮的作用, 对中、重(Ⅲ、Ⅳ级)皮损有治疗作用^[25]。田世禹等选用紫草、血竭、虎杖等中药制备加工成油纱条, 治疗Ⅲ、Ⅳ级急性放射性皮炎, 研究证明复方紫草中药油纱条创面包扎明显缩短了Ⅲ、Ⅳ级急性放射性皮炎的愈合时间, 差异均有统计学意义^[26]。

5.5.4 粉剂

胡爱民等将55例在放射治疗中出现Ⅱ°急性放射性皮炎的鼻咽癌患者随机分为两组:治疗组28例用双料喉风散治疗, 对照组27例用美宝湿润烧伤膏治疗。结果; 治疗组和对照组创面平均愈合时间分别为(4、14 ± 1、88) d和(11、96 ± 4、04) d, 两组比较P < 0.01。由此可见, 双料喉风散对急性放射性皮炎有较高的疗效, 明显缩短皮损愈合时间^[27]。

手术治疗对于慢性放射性皮炎反复溃疡、有明显恶化趋势, 放射溃疡药物治疗不明显或为了缩短疗程、防止恶变者往往采用手术治疗。在核事故情况下, 对于局部接受大于20Gy照射者, 进行早期手术治疗, 可减少解剖畸形和组织损伤程度。修复方法要依据创面的性质、切除的范围和深度, 以及创面基底情况和所在部位而选用方法, 较常见的有皮片移植、局部任意皮瓣、轴型皮瓣等皮肤移植和大网摸移植等。Margolis^[28]报道用任意皮瓣、肌皮瓣治疗下肢放射性溃疡取得了良好的效果。

6 结语

皮肤放疗反应的出现是因为射线破坏了基底层干细胞的DNA, 从而阻止了皮肤的再生。急性放射性皮炎的愈合一般在放疗结束后4周内, 小的斑片状的湿性脱皮有基底层细胞增生愈合, 而大片状的损伤由周围的上皮细胞移行修复。虽然皮肤反应的时间不长, 但会给患者带来瘙痒、疼痛等不适, 甚至影响放疗计划的顺利进行, 严重的反应如溃疡、坏死还会影响患者功能。因此, 需要探讨更为有效的防治措施。另外, 关于放射性皮肤损伤的研究, 虽然有一些报道, 但远远不够。例如目前以中、小样本的报道为主, 有些大样本的随机对照实验尚不能排除为累积资料的回顾性总结, 影响研究结论的真实性。故还应加强对科研方法的重视, 制定规范化临床研究设计方案, 提倡学者间合作寻求大样本、多中心前瞻性的随机对照实验, 以确保结论的客观真实和信服力。