随着核能和核技术及其应用的发展, 放射性核素污染及其产生的各种辐射效应也成为人们关注的一个重要问题, 尤其在核战争、核恐怖和核事故发生的情况下, 放射性核素的体内污染及其产生的内照射损伤是一个亟待解决的问题, 而放射性锶是核事故后产生远后放射生物效应的重要内污染核素之一。

锶有21种同位素, 其中17种同位素有放射性, 它们的半衰期从200ms(⁹⁷Sr)到28.5a(⁹⁰Sr)不等。其中毒理学意义较大的是⁹⁰Sr和⁸⁹Sr。由于锶的化学性质和钙类似, 所以一旦进入人体, 就会聚集在骨头上, 从而会造成内照射损伤和化学毒性损伤^[1]。

壳聚糖是甲壳质的脱乙酰产物, 是自然界中少见的的碱性多糖。具有优良的生物降解性、生物相容性和生物黏附性。壳聚糖的衍生物-壳聚糖-乙二胺四乙酸对某些金属离子具有良好的螯合能力^{[2, 3]}。

本实验室在原有研究的基础上^{[4, 5]}, 重点研究了壳聚糖-乙二胺四乙酸纳米粒预防性给药时对⁸⁹Sr的促排作用。

1 材料和方法 1.1 仪器与试剂

透射电子显微镜(JEM-200CX日本), GC -1500型γ放射免疫计数器(中国科技大学创新股份有限公司中佳分公司), 小动物整体成像系统(KodakIn-VivoImaging SystemsFx, 美国KODAK公司), 壳聚糖(Mw=3000, DD= 92.3%, 南通兴成生物制品厂), 乙二胺四乙酸(EDTA, AR, 沪试), EDAC(上海宝曼生物科技有限公司), 多聚磷酸钠(TPP, AR, 沪试), ⁸⁹SrCl₂氯化钠注射溶液(成都中核高通同位素有限公司, 批号2011 -10-1)。

1.2 实验动物

Balb/c小鼠(雄性, 体重22~25g, 南京鹏晟生物科技发展有限公司)。

1.3 方法 1.3.1 纳米粒子的制备

在本实验室建立的CTS-EDTA合成方法的基础上^{[4, 5]}, 参考文献[6, 7]的报道, 配置终浓度为0.5%(W/V)的CTS-EDTA溶液, 先用去离子水溶解, 再超声处理3min, 然后用1.2mol/LHCl溶液将pH值调至4~5, 用0.22μm的滤膜过滤; 配置浓度为0.5%的TPP溶液, 再用0.22 μm的滤膜过滤; 在室温、磁力搅拌的速度为(800±10)rpm的条件下, 按CTS-EDTA:TPP质量比分别为2:1, 将TPP溶液逐滴加入到pH值已调至4~5的CTS-EDTA溶液中, 滴速约为2s/d, 滴完之后再继续搅拌1h再进一步表征。

1.3.2 体内实验

实验分为即刻给药治疗组和预防给药治疗组, 每组又设对照组, 每组设8个平行样。即刻给药治疗组处理:每只小鼠腹腔注射37kBq共100μL⁸⁹SrCl₂注射液后立即静脉注射给药, 给药组每只小鼠注射100μL4mg/mL的CEC- Nano。对照组每只小鼠注射等量的生理盐水。预防给药治疗组处理:给药组每只小鼠先注射100μL4mg/mL的CEC- Nano, 30min后再腹腔注射37kBq共100μL⁸⁹SrCl₂注射液。对照组每只小鼠染毒30min后注射等量的生理盐水。每天重复给药。收集尿粪并测其放射性计数。染毒48h后解剖取脏器(心、肝、脾、肺、脑、小肠、肾脏、股骨、胸骨、颅骨), 称量每份脏器的重量后, 再测量每份脏器的放射性计数, 计算每克脏器的放射性计数。将尸体高温灰化后测小鼠体内放射性锶残留量。

1.4 统计方法

数据以x±s的形式表示, 采用SPSS19.0统计软件进行t检验统计学处理, P < 0.05表示差异有统计学意义。

2 结果与讨论 2.1 透射电镜

将CEC-Nano原液稀释30倍, 滴于铜网上, 待充分干燥后进行透射电镜扫描。透射电镜下观察到CEC- Nano的形态近似球形, 大小较为均一, 直径大约在150~180nm左右, 见图 1。

2.2 体内促排实验

小鼠腹腔注射⁸⁹Sr后5min、24h和48h分别麻醉, 通过小动物整体成像系统采集的静态平面图像如图 2所示, 图中高亮的红色区域表示体内滞留的放射性锶核素⁸⁹Sr的分布情况。染毒后立即显像时⁸⁹Sr呈全身均匀分布, 此时⁸⁹Sr刚进入血液系统随血液流经全身。24h时, ⁸⁹Sr已经明显聚集在骨组织中, 主要分布在股骨、颅骨和胸骨等处。48h时, ⁸⁹Sr向骨组织聚集的更加明显身体其他部位几乎没有分布。对比图 2中三个时间点, 可以发现前24h小鼠排泄的⁸⁹Sr比较多, 而从24h到48h, 小鼠体内⁸⁹Sr减少不是很显著。这是由于⁸⁹Sr是亲骨性核素, 一旦沉积在骨组织中, 就较难排出体外了。各组间比较, 24h时预防性给药组比其他组骨组织中沉积的⁸⁹Sr要少, 可能是当注射⁸⁹Sr后, 预防性给药能更快的和体内的⁸⁹Sr形成络合物延缓向骨组织中聚集。

48h后解剖小鼠取脏器, 称重测放射性计数。除骨组织外, 其他主要组织与器官中放射性锶含量处于本底水平, 数据不能进行统计分析, 故未在文中列举。从表 1中可以看出, 对照组中股骨与颅骨的放射性含量的比值为1.11~1.13。这与文献报道比较一致^[8]。预防性给药治疗组颅骨中放射性含量相比于生理盐水组和即刻给药治疗组差异均有统计学意义, p < 0.05。预防性给药治疗组颅骨中放射性含量相比对照组差异有统计学意义, p < 0.05。而股骨中的放射性含量在各组间差异无统计学意义, p>0.05。虽然CEC-Nano在即刻给药治疗时与对照组相比差异无统计学意义, 但是在颅骨和胸骨中, 其放射性较对照组还是有一定的下降。

将小鼠放入代谢笼, 每天收集尿粪测其放射性计数, 见表 2。第二天尿粪排泄量中放射性含量较第一天明显下降。而且第二天各组放射性都处于同一水平, 差异均无统计学意义。说明当⁸⁹Sr进入体内后的排泄跟时间有关, 随着时间的延长会在骨中聚集, 沉积后的放射性锶转移交换的速率明显下降。所以, 一旦发生放射性锶内污染时, 越早用药, 效果越佳。预防性给药治疗组比对照组明显升高, p < 0.05, 与即刻治疗性给药组相比虽无统计学意义, 但也有一定的升高。

小鼠注射⁸⁹Sr 48h后将其处死并灰化, 测定收集的残灰的放射性, 代表小鼠经过排泄后体内残留的总放射性。结果如图 3所示。经统计学分析, 预防性给药治疗组和即刻治疗性给药组与对照组相比较差异均有统计学意义, p < 0.05, 预防性给药治疗组与即刻治疗性给药组相比较, 也明显更较低, p < 0.05, 结果表明, 预防性给药治疗组对放射性锶的促排效果比即刻治疗性给药组更好。

3 结论

本实验室离子凝胶法制备的CEC - Nano粒径均一, 对小鼠体内的⁸⁹Sr具有一定的促排作用^{[4, 5]}。本文采用相同的方法制备出CEC-Nano, 重点观察其预防性给药时的促排效果。从注射⁸⁹Sr后的显像图中可以看出预防性给药能够延缓⁸⁹Sr向骨组织沉积, 这样就能加速排出体内的⁸⁹Sr。结合不同骨头中放射性的比较图, 股骨、颅骨和胸骨为⁸⁹Sr在体内的主要沉积处。预防性给药时颅骨中放射性含量比其他组明显降低。通过收集尿粪观察小鼠体内⁸⁹Sr的排泄情况, 发现预防性给药能够提高尿液的排泄, 而治疗性给药却没有。将小鼠处死灰化后测其放射性, 比较各组间差异, 预防性给药组小鼠体内残留的放射性明显比其他组要低。所以预防性注射CEC-Nano能够加速排出小鼠体内的⁸⁹Sr。