辐射旁效应(bystander effect)是指通过细胞接触或细胞间通讯将直接受辐射细胞的应答传递给周围未受辐射的细胞, 后者也表现出与辐射细胞类似的生物学效应^[1]。现在已经公认电离辐射能够通过接收某些信号, 诱发非直接照射部位细胞、分子改变^[1], 而旁效应通过体外细胞培养, 组织种植^[2]和3D模型很好的验证^[3]。头颈部电离辐射诱发体内旁效应, 以及对脑发育的影响的研究, 国内外报道比较少。本实验通过建立体内旁效应的动物模型, 对孕鼠进行单次急性头部照射, 并同时设置全身照射组作为同剂量对照组, 观察胎鼠状态, 记录胎鼠个数, 大小, 有无死胎、畸胎及流产等及胎鼠脑组织中MeCP2蛋白含量变化, 探讨电离辐射诱发体内旁效应损伤表现及可能机制。

1 材料和方法 1.1 动物

选用性成熟的昆明小鼠, 雌鼠体重30 ~ 35 g, 35只, 由苏州大学动物实验中心提供, 于安静、温暖(22℃)、光线柔和的环境中饲养。

1.2 照射源

⁶⁰Co治疗机, 剂量率63cGy/min, 由苏州大学中心实验室提供。

1.3 方法

健康性成熟小鼠, 雌雄以2: 1每晚8时合笼, 次日晨8时查阴道, 发现阴栓为孕零天, 于孕9d时予以处理, 随机分为7组:空白对照组、0.5Gy全身照射组、0.5Gy头部照射组、1.0Gy全身照射组、1.0Gy头部照射组、2.0Gy全身照射组及2.0Gy头部照射组, 每组5只。空白对照组:予以假照射; 照射组小鼠用固定器固定后用⁶⁰Co治疗机进行单次急性全身垂直照射和单次急性头部垂直照射, 头部照射时以耳后缘为界, 对头部进行缩野照射, 同时身体余部再用3cm铅块屏蔽, 剂量率63 cGy/min。见图 1, 同时每日观察并记录孕鼠一般状况, 有无早产、流产和称体重。于孕18d乙醚麻醉后剖腹取胎鼠置于冰浴中, 并观察有无死产, 畸胎等, 取活胎快速断头剥离胎脑, 用镊子剥离脑膜及血管, 移入离心管备用。

1.4 MeCP2蛋白表达含量测定

取胎脑全脑称重, 按1: 10质量/体积加入预冷的裂解液中, 于冰浴中用玻璃匀浆器制成胎脑匀浆, 于4℃12 000rpm离心4min, 小心吸取上清液。取上述胎脑上清液测蛋白含量, 取一定量上清液用western-blot方法检测胎鼠脑组织中MeCP2蛋白含量变化。

1.5 数据的处理

运用统计描述统计孕鼠一般状况和胎鼠情况以及MeCP2蛋白表达含量。

2 结果 2.1 孕鼠饲养期间一般状况观察及孕鼠18d剖腹后胎鼠形态学观察

孕鼠饲养期间0.5Gy全身照射组一只孕鼠孕7d时出现全身青紫, 后有加重, 饮食正常; 1.0Gy全身照射组一孕鼠孕17d、18d时出现喘, 1.0Gy头部照射组一孕鼠孕18d时阴道口有血迹, 笼内未见新生鼠, 饮食正常。余孕鼠无明显异常。孕鼠18d剖腹后胎鼠观察(见图 1), 与空白对照组比较, 电离辐射照射孕鼠后, 随着剂量的增加, 胎鼠死胎率、畸胎率、流产率以及出现胎鼠死胎、畸胎、流产的孕鼠数呈上升趋势, 1.0Gy组与2.0Gy组无显著差异, 孕鼠头部受照后, 胎鼠死胎率、畸胎率、流产率与孕鼠全身直接受照后胎鼠变化无显著差异。

2.2 胎鼠脑组织甲基化结合蛋白MeCP2含量的影响

Western-blot检测, 得到了分子量约为84KD蛋白条带。与空白对照组比较, 0.5Gy、1.0Gy和2.0Gy头部照射组处于孕鼠腹部位置未受直接辐射的胎鼠脑组织MeCP2表达量均明显降低; 1.0 Gy和2.0Gy全身照射组MeCP2表达量亦均明显降低; 0.5Gy头部照射组MeCP2表达量较其全身照射组低, 1.0Gy和2.0Gy头部照射组与全身照射组损伤效应相近, 无明显差异, 如图 3。

3 讨论

众所周知, 发育中的胚胎或胎儿对电离辐射高度敏感。辐射照射对胚胎或胎儿的效应, 取决于照射发生相对于受精的时间以及总的吸收剂量。在植入前期(受精后0 ~ 10d)和植入期(受精后10 ~ 14d), 辐射可导致受精卵或胚胎死亡, 存活的胚胎将继续正常发育, 发生的效应呈“全或无”现象。受精后第3 ~ 8周(主要器官形成期)受照可导致畸形、白内障和生长缓慢。妊娠第8 ~ 25周中枢神经系统对辐射特别敏感, 甚至可能引起严重的智力迟缓(SMR), 第8 ~ 15周的危险度大于第16 ~ 25周^[4]。

实验观察显示, 电离辐射照射孕鼠后, 随着剂量的增加, 胎鼠死胎率、畸胎率、流产率以及出现胎鼠死胎、畸胎、流产的孕鼠数呈上升趋势。异常胎鼠有的表现为早期即发生死亡, 致使胚胎发生吸收, 剩下一点残骸附着于胎盘, 或者仅剩胎盘, 有的胎鼠则表现为晚期死亡, 胚胎形态完整, 个头或小或与活胎无异, 有的只是孕鼠18d时阴道流血, 出现晚期流产现象。由于本实验是针对孕9d小鼠头部或者全身单次急性外照射, 而小鼠孕6 ~ 13d相当于人类胚胎9 ~ 60d, 对辐射特别敏感。实验结果同时显示, 孕鼠头部受照后, 胎鼠死胎率、畸胎率、流产率与孕鼠全身直接受照后胎鼠变化无显著差异。1.0Gy剂量组, 头部照射后胎鼠异常率大于空白对照组出现的胎鼠异常率, 首先推测可能与电离辐射诱发体内旁效应有关, 电离辐射照射孕鼠头部后, 头部损伤产生某些活性物质, 传递到胎鼠, 诱发辐射增敏效应, 胎鼠出现死亡畸形概率增加, 相对于孕鼠全身直接照射, 头部照射组胎鼠异常率要稍大, 也可能是电离辐射直接照射胚胎后胚胎损伤大, 早期就发生死亡, 然后宫内完全吸收而未被观察到。2.0Gy剂量组无论孕鼠头部照射还是孕鼠全身直接照射, 胎鼠异常率明显高于空白对照组, 0.5Gy剂量组和1.0Gy剂量组, 说明电离辐射诱发的效应与剂量有关。

Western-blot检测, 除0.5Gy全身照射组外, 余各剂量组MeCP2表达量明显降低, 组间无明显差异。甲基化CpG结合蛋白(methyl-CpG binding proteins, MeCPs)是指能特异识别mCpG二核苷酸并与之结合的一类核蛋白, 而对mCpG周围序列无特异要求, 从而广泛参与基因转录抑制。该蛋白家族主要作为转录抑制子发挥转录抑制作用, 介导DNA胞嘧啶甲基化所致的基因沉默^[5]。迄今已发现MeCPs家族含有包括MeCP1和MeCP2及其同源蛋白共6个成员。电离辐射诱发胎鼠MeCP2表达改变, 致使DNA甲基化异常, 导致正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育维持异常, 同时甲基化状态的改变是引起肿瘤的一个重要因素, 导致胎鼠基因组的不稳定, 如染色体的不稳定、可移动遗传因子的激活、原癌基因的表达和抑癌基因的不表达, 致使发生癌症的几率提高^[6]。

实验结果表明全身照射后, 电离辐射诱发MeCP2表达减少, 促使DNA去甲基化, 最终可能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变。同时表明, 孕鼠头部照射后, 处于孕鼠腹部位置的胎鼠脑组织MeCP2表达量明显降低, 进一步从分子水平证实了电离辐射能够诱发体内旁效应, 通过体内某些途径, 将亲代的损伤效应传递给了子代胎脑, 且其损伤程度类似于胎鼠脑组织直接受照后损伤反应。值得注意的是0.5Gy头部照射组MeCP2表达量较0.5Gy全身照射组低, 是否与头部受照后旁效应被级联放大有关, 有待进一步增加低剂量组进行深入研究。

MeCP2作为一种重要的甲基化蛋白, 贯穿整个基因, 选择性识别和结合, 平衡甲基化胞嘧啶, 是重要的转座沉默因子和染色质调节因子^[7]。哺乳动物基因大部分有其固有的甲基化模式维持其功能。最近研究显示, 在DNA高度重复序列, 逆DNA转座子上有高水平的DNA甲基化。同时显示DNA甲基化减少转座子活化, 进一步基因不稳定性, 那么同样的, MeCP2的下调也是促使细胞倾向于转座子活化, 突变及基因不稳定, 从而致癌^[8]。

综上所述, 电离辐射作用于孕鼠后, 无论是直接照射腹部还是作用头部, 在一定剂量范围内, 旁效应器官胎脑甲基化结合蛋白MeCP2表达都下降; 同时随着剂量的增加可能导致确定性效应和随机性效应增加, 如死胎、畸胎、发育障碍及出生后智力低下、行为异常以及癌症几率的提高等。DNA去甲基化和MeCP2水平的改变在旁效应器官胎鼠脑组织中, 其确切的生物学效应和对DNA序列性质的影响有待以后进一步研究。

(注:本实验于苏州大学医学部放射医学与防护学院, 江苏省放射医学与防护重点实验室完成。)