许多病理情况下(如心肌梗塞、心肌炎、某些药物毒性、心脏移植的排斥反应等)心肌细胞可以发生损失或坏死, 而直接判断心肌损伤程度的特异方法之一是心肌显像。由于抗心肌肌凝蛋白重链的单链抗体(ScFv)的分子量仅为完整McAb的1/6, 它产生人抗鼠抗体的效应极小, 在血中清除快, 靶/非靶比值大, 图像清晰; 分子穿透能力强, 易达病变部位, 能够及时识别心肌梗塞患者的存活心肌, 尽早施行冠状动脉血运重建术等治疗措施, 能有效地改善患者的预后, 有利于放射免疫显像和放射免疫治疗^[1-3]。本研究利用抗人心肌肌球蛋白重链(human cardiac myosin heavy chain, HCMHC) McAb杂交瘤细胞^[4], 提取RNA, 合成第一链cDNA, 以这第一链cDNA为模板, 对重链可变区基因V_H和轻链基因可变区V_L进行PCR扩增, 并纯化回收基因片段, 为心肌显像及其显像剂抗HCMHC单链抗体的研究打基础。

1 材料与方法 1.1 主要试剂与仪器

TRI_ZOL^R试剂(货号15596-026, 美国Invitrogen life technologies公司); DNA Ladder(Gene Ruler^TM 100bp DNA, 货号SM0241, Fermentas life sciences公司); Taq DNA聚合酶(货号M1661, 美国Promega公司); 引物(上海博亚生物技术有限公司合成); RT-PCR试剂盒(Super Scripe^TM First-Stand Synthesis System for RT-PCR, 货号11904-018, 美国Invitrogen life technologies公司); PCR仪(PTC-100^TM Programmable Thermal Controller美国MJ Research公司); 电泳仪(Power PAC 200型, Bio-Rad公司); 分子成像仪(Doc 1000型, 美国Bio-Rad公司)

1.2 RNA的提取和鉴定

抗HCMHC McAb杂交瘤细胞, 8×10⁶个细胞/管, 每管加入1ml TRI_ZOL试剂。提取的RNA加入75%乙醇, -20℃保存; 用UV-3000紫外分光光度仪, 测定所提取的RNA的OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值, 进而用RNA浓度(μg/μl) = OD₂₆₀×核酸稀释倍数×40/1 000公式, 计算出RNA的浓度。

1.3 RNA的稳定性与贮存温度关系

为了观察所提取的RNA在无Rnase水中, 其稳定性与贮存温度的关系, 进行如下实验。取一管在1ml 75%乙醇中, 且存在-20℃下的RNA, 弃去75%乙醇, 空气干燥, 加入30μl无Rnase水, 58℃下, 温育10min, 分成两份, 分别贮存在4℃和-20℃下, 在不同时间, 用TE稀释样品和作对照溶液, 测定它们的OD₂₆₀、OD₂₈₀进行相关计算和比较。

1.4 从RNA合成第一链cDNA

使用Super Script^TM First - Strand Synthsis System试剂盒, 把反应混合物轻混, 短暂离心后, 42℃, 温育2min。每管分别加入1μl(50U) Super ScriptⅡRT, 42℃下, 温育50min, 70℃下, 温育15min, 马上冰浴, 终止反应。每管分别加入1μlRNase H, 轻混, 短暂离心, 37℃下, 20min温育, 实现酶切, 以除去RNA。-20℃保存。

1.5 cDNA的鉴定

用UV-3000紫外分光光度仪, 取3μl cDNA样品, 加水至300μl, 混匀, 测定OD₂₆₀、OD₂₈₀和OD₂₆₀/OD₂₈₀比值并计算cDNA浓度。1%琼脂糖糖凝胶电泳, 电压35V, 电泳时间1.5h。取下琼脂糖凝胶, 用BiO-Rad公司Gel Doc 1 000分子成像系统进行紫外扫描分析。

1.6 PCR扩增V_H和V_L基因

根据Ig可变区的序列特点和引物设计原则, 设计了为扩增V_H和V_L基因的各一对引物。把反应管放在PCR仪上, 按下列程序作热循环:预变性(94℃, 4min); 变性(94℃, 2min); 退火(62℃, 1min)×30;延伸(72℃, 1min); 延伸(72℃, 10min)。反应结束后, 把反应管放-20℃保存。

1.7 V_H和V_L基因的鉴定和回收

用1.7%琼脂糖凝胶, 制胶和电泳缓冲液为1×TBE, 电泳电压为50V, 电泳时间2h。用树脂型^TMPCR产物纯化试剂盒回收基因片段。

1.8 MgCl₂浓度和循环温度的最优化

以同样热循环条件扩增V_H和V_L基因, 取退火温度分别为62℃和67℃, 观察MgCl₂浓度的影响。

2 结果 2.1 RNA的提取和鉴定

OD₂₆₀/OD₂₈₀比值达到1.726, 浓度为0.794μg/μl。

2.2 RNA的稳定性与贮存温度的关系

所提取的RNA, 当溶解在水中时, 无论在4℃还是在-20℃下, 短暂贮存也不行, 如无-70℃冰箱, 只能把RNA存于75%乙醇中, 存在-20℃或- 30℃冰箱中。当应用时, 弃掉75%乙醇, 风干, 在55 ~ 60℃下, 重溶于无Rnase水中。

2.3 cDNA的鉴定

所合成的cDNA的OD₂₆₀/OD₂₈₀比值为1.648, 理论值应为1.6 ~ 1.7, 纯度是好的。cDNA浓度为0.824 μg/μl。cDNA的琼脂糖凝胶电泳分析, 合成的已脱RNA和未脱RNA的第一链cDNA, 纯度较高达95%。

2.4 V_H和V_L基因的鉴定

用PCR扩增V_H和V_L基因的琼脂糖凝胶电泳鉴定结果见图 1 ~ 图 3所示。扩增产物的琼脂糖凝胶电泳带呈单一明亮泳带, V_H和V_L基因分子量分别为340bp和320bp, 与文献相一致。

3 讨论

用抗肌凝蛋白单克隆抗体显像的研究始于上世纪80年代初, 当时是将完整的抗体分子直接应用, 发现由于完整的抗体分子大, 抗体到达损伤部位显像缓慢、体内蓄留时间长、非特异摄取多、并可刺激产生人抗鼠抗体等缺点, 因而发展为仅用其抗体分子的Fab片段。美国学者Khaw BA.最先将这种Fab片段用于狗心肌梗塞模型的显像^[5]。虽然Fab片段与抗原结合性保留、分子量减小、免疫原性减弱, 但Fab的结构内毕竟含有一部分鼠源蛋白结构, 仍可刺激抗鼠抗体的产生。因此, 近年来Nedelman MA.尝试设计去掉所有恒定区, 只保留抗体可变区部分的单链可变区片段, 即ScFv抗体(single chain Fv fragment) ^[6]。理论上这样的ScFv抗体既保持了与肌凝蛋白重链的结合能力, 又去掉了非必需部分, 使分子进一步变小, 体内清除加快, 成为显像剂的理想选择。噬菌体表面展示技术, 是利用噬菌体能将筛选的基因产物表达于噬菌体表面, 与固定在支持物上的肌凝蛋白发生特异结合而被筛选出来, 这样就容易地从大量的重组噬菌体中富集出表达正确的ScFv(VL-Linker - VH)基因。这种有目的的筛选目标基因的方法克服了传统基因工程盲目筛选的不足, 使筛选效率大大提高。之后, 再把筛选到的ScFv基因用大肠杆菌表达, 获得与抗原结合特异的ScFv抗体, 并进行动物模型体内的初步实验, 验证ScFv抗体体内的显像作用, 为心肌损伤与急性心肌梗塞的定位诊断提供更特异更有效的方法。

RNA的稳定性是在改变细胞环境情况下, 或当分离、纯化、保存, 以及进行物理和化学操作时, RNA分子保留其原结构状态和抗拒降解的程度。其中RNA的保存条件至关重要, 是后续实验的基础。本实验所提取的RNA溶解于无Rnase水中, 无论贮存在4℃还是-20℃下, 其OD₂₆₀和OD₂₈₀都随贮存时间的延长而增加, 只是在4℃下, 随时间延长以近似指数形式增加, 而在-20℃下, 随时间延长, 开始增加迅速, 而后趋于稳定; 无论在4℃还是在-20℃下, 由于OD₂₆₀和OD₂₈₀都随贮存时间而增加, 所以OD₂₆₀和OD₂₈₀比值在两种温度下差别不大, 但随时间延长都在下降; 在4℃还是在-20℃两种温度下, 由于OD₂₆₀随贮存时间延长而增加, 所以由此计算出的RNA的浓度也随贮存时间延长而增加, 而增加趋势与OD₂₆₀的增加趋势相同。总之, 所提取的RNA, 当溶解在水中时, 无论在4℃还是在-20℃下, 短暂贮存也不行, 如无-70℃冰箱, 只能把RNA存于75%乙醇中, 存于-20℃或-30℃冰箱中。

PCR体系中的基本要素有: DNA模板、一对寡聚DNA引物、耐热DNA聚合酶和四种单核苷酸。PCR是以指数形式扩增, 经过25-30个循环后, 扩增倍数可达10⁶, 使目的DNA片段得到扩增。本实验目的是用所合成的cDNA为模板, 用PCR扩增抗人心肌肌凝蛋白重链(HCMHC)单克隆抗体可变区重链基因V_H和轻链基因V_L。影响PCR结果的主要因素是MgCl₂浓度和循环温度, 为了使这些条件最优化, 进行了充分的实验选择。取退火温度分别为62℃和67℃, 分别用2、3、4、5和6μl 2.5mM/L MgCl₂, 观察MgCl₂浓度的影响。由电泳图可见, PCR扩增的反应体系中, MgCl₂浓度影响很大, 且对不同引物其影响是不同的, 在V_H扩增中, MgCl₂在4和3μl时, 电泳呈明亮单一带, 当2μl为时, 电泳带则不明显, 而在V_L扩增中, MgCl₂在4、3和2μl时, 电泳带都呈明亮单一泳带。