1985年，Fenech等首先建立了胞质分裂阻滞微核法(cytokinesis-block micronucleus method)，简称CB(细胞松弛素B)微核法^[1]。随后国内外一些实验室相继建立和改进了此方法，为与传统微核实验相区别，研究者称之为CB微核法或CB法微核实验，通俗称为双核微核实验。目前此项实验技术已比较成熟，并已广泛用于辐射损伤、遗传毒理、药物筛选、职业人群检测及毒性评价等领域。CB是一种能抑制细胞质分裂而不影响细胞核分裂的试剂，CB法微核实验只计数一次核分裂后双核淋巴细胞中的微核数，所观察到的双核中的微核就是第一次有丝分裂细胞中的微核，因此它克服了常规培养微核法不能识别一次核分裂后的细胞所造成的实验结果不准确，难以重复等缺陷，实验的敏感性、准确性和重复性均得到提高。

本研究，通过公认的辐射损伤模型，以双核淋巴细胞微核率为观察终点，采用CB法微核实验，比较不同剂量X射线照射的离体全血的微核率，来建立一种新的方便的检测细胞DNA损伤修复能力的实验方法，用于职业人群的流行病学调查。

1 材料与方法 1.1 照射条件

照射剂量由省直某医院放疗科提供，总剂量为0.5Gy，照射源为PRIMUS-H直线加速器(SIEMENS)，6MV-X，速调管(驻波)。照射野为20cm × 30 cm，中心距(照射样离源中心距离) 100cm。照射样品在该条件下在该点的剂量率是200cGy/min。对照样本(即0剂量)除未照射外，所有条件同照射组。

1.2 血样

血样取自笔者本人，女，36岁，身高157cm，体重51kg，平素健康，近期内从事职业毒理学工作，无菌条件下抽取静脉血20ml，注入无菌肝素真空抗凝管内，立即送到实验室培养。

1.3 CB法微核实验

参考Fenech方法并略加改进。

1.3.1 主要仪器和试剂

含PHA的RPMI 1640培养基的细胞培养瓶(中国协和医科大学); 吉姆萨氏染液、细胞松弛素B (Sigma公司); CO₂培养箱(REVCO HABITATTM)，显微镜(OLYMPUS日本)，PRIMUS-H直线加速器(SIEMENS)。

1.3.2 操作步骤

取0.5ml肝素抗凝静脉血，分别加入30个含PHA的RPMI1640培养基的细胞培养瓶中(含5ml培养基)，随机平均分为六组，于37℃，5% CO₂培养箱内培养24h，在室温下，按组别用不同剂量的X射线照射细胞，X射线剂量分别为0，0.5，0.75，1，2，4 Gy，剂量率为2 Mu /min; 继续培养至44h，加细胞松弛素B应用液100μl，终浓度为6μg /ml; 培养至72h收获，然后低渗、固定、涂片、染色和镜检分析。

1.3.3 镜检分析方法

盲法阅片，低倍镜下寻找细胞分散均匀的视野，转油镜下观察。选择胞浆完整的双核淋巴细胞，微核位于细胞质中，与细胞核相切或完全分开，边缘光滑，嗜色性与细胞核完全一致，大小为主核的1 /15至1 /3，不与主核接触^[2]。计数1 000个双核淋巴细胞中含一个、两个或多于两个微核的细胞数，以计算双核微核细胞率(以下简称微核率)。微核率(‰) =含微核的双核细胞数/1 000个双核细胞× 1 000‰。正常单核淋巴细胞见图 1，正常双核淋巴细胞见图 2，含有1个微核的双核淋巴细胞见图 3，含2个微核的双核淋巴细胞见图 4，含3个微核的双核淋巴细胞见图 5，含4个微核的双核淋巴细胞见图 6; 图中箭头所指为微核。

1.4 个体DNA损伤修复能力检测实例

实例1:选取5名正常人作为研究对象，分别编号甲、乙、丙、丁、戊，取每名研究对象肝素化全血分别接种于两个含PHA的RPMI1640培养基的细胞培养瓶中(含5ml培养基，0.5ml全血/瓶)，于37℃，5% CO2培养箱内培养24h。在室温下，其中一份用0.5 Gy剂量的X射线照射细胞，剂量率为2 Mu /min，另外一份未被X射线照射(0剂量组); 余操作同上面所述3.2和3.3。以DRC代表细胞DNA损伤修复指数: DRC指数= (1-X射线照射的微核率) / (1-未被X射线照射的微核率)。

实例2:选取某橡胶厂10名丁二烯接触工人及10名非丁二烯接触锅炉工作为研究对象，全为汉族男性，年龄在25 ~ 35岁之间。无菌条件下，抽取肘静脉血2ml，置于5ml肝素抗凝管内，立即在冷藏条件下运送至实验室，按照以上步骤操作，检测DRC指数。根据往年检测资料，获得接触工人丁二烯的暴露剂量，10名工人的暴露剂量平均为0.3mg /m³(8h时间加权平均浓度，TWA)，低于国家职业接触限值的要求(PC-TWA为5 mg / m³)。

1.5 统计学处理

应用SPSS 16.0统计软件对所得数据进行分析，微核率的比较用两样本率比较的T检验，照射剂量与微核率两者的关系采用相关性分析。

2 实验结果

实验共观察了30例不同照射剂量下的双核淋巴细胞微核率，结果见表 1，对照组微核率为10.6‰。

本研究照射剂量范围为0.5 ~ 4.0 Gy，在0.5 Gy照射后微核率从正常的10.6‰增至17.4‰，表明在0.5 Gy照射后微核率明显增加，差异具有显著性(t = 2.64，α = 0.030)，DRC指数为0.993; 0.75至4 Gy剂量照射组，微核率都显著高于对照组，由26.8‰增至212.6‰，DRC指数却明显降低，由0.984降为0.796，见表 1。0 Gy剂量组微核率为10.6 ± 1.2，其中含2个微核的细胞率为0.8 ± 0.2，未发现含3个或4个微核的双核细胞; 4.0 Gy剂量组微核率为212.6 ± 32.8，其中含2个微核的细胞率为64.8 ± 15.3，含3个微核的细胞率为23.8 ± 6. 4，含4个及以上微核的细胞率为8.2 ± 3.3;与0 Gy剂量组比较，微核率及微核个数明显增多，见表 2。将微核率取对数，其与照射剂量的相关系数R为0.924，两者在0.5 ~ 4.0 Gy范围内呈良好线性相关，随着照射剂量增大，含微核的双核细胞数明显增多，且细胞中含有的微核个数也明显增多，趋势非常明显，这与以往报道一致^[3]。阅片中还发现，在此实验条件下，以小于0.75 Gy剂量照射时，死亡细胞数增多并不明显; 但以大于0.75 Gy剂量照射时，随着照射剂量的增加，死亡细胞数显著增加。此现象在2和4 Gy剂量组非常明显。

个体DNA损伤修复能力检测实例1，结果见表 3。不同个体，0.5 Gy剂量X射线照射前后，微核率差异显著，P = 0. 004(α = 0.05)。根据公式，计算可得DRC指数。

个体DNA损伤修复能力检测实例2，研究对象的基本特征见表 4，经过非参数检验，接触组和对照组年龄比较: mann-Whitney U值为48.5，P值为0.909，在0.05显著性水平上，年龄在两组间无统计学差异; 两组饮酒和吸烟比较: Kolmogorov-Sminov Z值均为0.447，P值为0.988，吸烟、饮酒在两组间亦无统计学差异。丁二烯接触组与对照组比较，两独立样本非参数检验mann-Whitney U值为32.5，P值为0.179，无明显差异，结果见表 5。

3 讨论

DNA损伤修复是机体的一种防御机制，对于维持细胞DNA完整性和细胞周期的正常调控起着重要作用。DNA损伤修复的缺陷会增加突变易感，从而导致肿瘤的发生^[4]。不同类型的DNA损伤是由不同的途径修复的，主要有:核苷酸切除修复(NER)、碱基切除修复(BER)、同源重组修复(HRR)、非同源末端连接(NHEJ)和错配修复(MMR)等，评价DNA修复能力往往也只是评价个别途径的修复能力^[5]。人外周血淋巴细胞对辐射损伤非常敏感，是辐射损伤的靶组织。研究发现，由X射线诱导的淋巴细胞的单双链断裂主要是通过BER，HRR和NHEJ途径修复^{[6, 7]}。

微核是检测染色体损伤后期的效应标志物，在染色体损伤后数月甚至数年仍可通过外周血CBMN检测到，其发生率在一定剂量范围内随辐射剂量的增大而增加。CB法微核实验解决了微核培养的动力学问题，计数第一次有丝分裂周期中的含微核的双核细胞数，使微核计数更加准确，重现性好，能够通过染色体损伤的动态变化定量分析细胞修复损伤的能力。实验采用0.5 ~ 4 Gy剂量范围照射培养24h后的离体全血细胞，结果显示，随着受照剂量的增大，微核率明显增加，且微核的个数也增多。与对照组比较，0.5 Gy剂量组微核率变化已有统计学差异(α = 0.05);其他剂量组微核率差异更加明显。阅片显示，0.5Gy剂量组细胞存活状况与对照组相似; 其他剂量组细胞存活状况较对照组差，随着受照剂量增加，细胞死亡数也增大。DRC指数反映细胞DNA损伤修复能力，DRC指数越大，则说明细胞修复能力越强。实验中，X射线照射剂量由0.5到4 Gy，微核率增高，DRC指数降低; 说明同一个体，照射剂量越大，染色体损伤越严重，细胞DNA修复能力越差。不同个体，细胞DNA修复能力不同，同一剂量照射，微核率亦不同，计算可得DRC指数。通过比较有害因素暴露人群与对照人群的DRC指数，以检测职业人群的DNA损伤修复能力，说明暴露因子对人体修复能力的影响作用。实例2说明了丁二烯(一种确定人类致癌物)的暴露对人体修复能力的影响状况，P值为0.179，在0.05水平上无差异，可以认为丁二烯的暴露不影响人体修复能力，这可能是由于样本例数太少，暴露浓度太低造成的，也可能是丁二烯本身并不损伤人体的修复能力所致。在今后的研究中，需要增大样本例数，细化调查内容，尤其是职业史和疾病状况的调查，进一步探讨丁二烯对人体修复能力的影响。

本研究提供一种客观地检测、评价机体细胞DNA损伤修复能力的方法，以双核微核作为观察终点，X射线作为诱变剂来检测职业人群的DNA损伤修复能力，分析职业人群和对照人群之间DNA修复能力的差异，以研究职业有害因素对细胞DNA修复能力的影响，从修复机制上阐明毒物的毒性作用机理^[8]。此方法操作简单、灵敏度高、重现性好，可适用于大面积职业流行病学调查。