基因芯片(gene chip)又称DNA芯片或DNA微阵列, 是通过微电子技术和微加工技术将大量特定序列的DNA片段或寡核苷酸片段按矩阵高密度固定于玻璃、硅片等载体上制作而成。1994年, 用于检测地中海贫血症病人血样基因突变的第一个基因芯片诞生^[1]。基因芯片技术是在基因芯片基础上发展起来的一门新技术, 最早是由俄罗斯科学院恩格尔哈得分子生物学研究所和美国阿贡国家实验室的科学家提出的, 以20世纪70年代的Southern印迹法杂交技术为基础。其原理是利用杂交法测定核酸序列。将待测样品用荧光分子标记后, 与已知芯片上的DNA或寡核苷酸片段杂交, 通过荧光扫描及计算机分析从而获得大量的基因信息, 其突出特点在于能够对微量样本中的核酸序列信息进行快速、准确、高通量的检测和分析。自1995年Stanford大学的Schena等^[2]首次成功运用cDNA微阵列技术定量比较基因表达变化以来, 基因芯片技术已扩展到多个研究领域如基因表达谱分析、突变检测、基因组文库作图、杂交测序、药物研究与开发以及工农业、食品与环境监测等^[3]。

辐射能引起机体分子水平的复杂调控, 不同组织细胞、同一组织来源不同性状的细胞, 其基因对不同剂量的辐射反应各异, 不同剂量辐射后可引起细胞或组织多种差异基因表达上调或下调。基因芯片技术是建立在杂交序列基本理论上的分子生物学技术, 因此可以完整地研究整个细胞或器官全部基因变化, 通过全基因组分析, 可发现电离辐射诱导的基因差异表达。因此, 在辐射生物学领域具有重要作用, 推动了一种新的分子放射生物学方法的建立。本文将就基因芯片技术近年来在放射生物学领域的应用进展及其发展前景做如下综述。

1 基因芯片技术在几个辐射方面的应用 1.1 揭示低剂量辐射生物效应机理, 发现新型辐射诱导基因

以前, 低剂量辐射生物效应一般由大剂量辐射反应类推而来, 但诸多的实验证据表明, 细胞或机体对低剂量辐射的反应与高剂量相比存在本质区别, 存在适应性反应、超敏性、旁效应^[4]等特点。

龙贤辉等^[5]应用基因芯片技术分析5cGy低剂量γ射线照射正常人淋巴母细胞(AHH-1)基因转录产物水平变化后发现, 11个基因表达上调, 9个基因表达下调; 用RT-PCR的方法分别扩增了6个表达上调基因:Connexin43、BMPR2、NOL6、LOC51760、LYK5、DKEZP686P0190和4个表达下调基因:CCNB1IP1、SDPR、CCT5、KIAA0231, 结果与芯片结果相一致, Western blot证实Connexin43基因在翻译水平表达亦增加, 为辐射诱导表达基因。Lu等^[6]用基因芯片技术在研究低剂量γ射线照射引起人淋巴细胞损伤后P53基因的作用中发现TK6和NH32在转录中起着关键作用, 并用RT-PCR对MAD2L1、PTTG1、STMN1这三个基因进行验证, 显示了很好的一致性。Fachin等^[7]利用基因芯片技术研究人外周血淋巴细胞在10、25、50cGyγ射线照射后基因表达的变化, 结果显示在这3组不同剂量照射下分别有25、35、33个差异表达基因, 共同差异表达的基因有34条, 其中上调基因是SERPINB2、C14orf104等, 下调基因是CREB3L2、DDX49、STK25、XAB2等。综上, 筛选出的差异表达基因有助于阐述低剂量辐射生物效应机理, 部分基因有可能成为低剂量辐射暴露的生物标志物。

1.2 开发空间辐射的屏蔽技术、评价空间辐射生物效应和健康危害

空间复杂的辐射环境对航天员健康的影响, 是人类发展空间技术、开发太空资源所面临的一个严峻问题。空间环境辐射成分既有低LET辐射, 也有高LET辐射, 对包括细胞死亡、凋亡、基因突变、癌变、染色体畸变等在内的生物效应, 高LET辐射比低LET辐射的效应更强^[8]。Rithidech等^[9]研究⁵⁶Fe照射CBA/CaJ鼠的生物效应, 结果表明, ⁵⁶Fe照射产生的损伤明显大于¹³⁷Seγ辐射效应, 其中, 染色体交换是1.6倍, 异常细胞是4.3倍, 单体型和染色体型的断裂是4.2倍。由于微束照射技术的应用, 可以精确地将单个α粒子定点注入某个细胞的特定部位, 由此而观察到周围临近的未受照射细胞也产生类似的辐射效应, 如基因突变、细胞凋亡等, 从而导致总体辐射效应高于常规理论预期的辐射损伤效应, 这就是旁效应。Mothersill等^[10]研究发现, 将辐射粒子打在细胞胞浆部位而非传统认为的细胞核内DNA靶分子, 同样能产生辐射旁效应, 由此提出了电离辐射的非靶效应概念。确定辐射的DNA靶效应和非靶效应, 对评价航天员空间飞行的辐射危害、设计屏蔽措施, 以及评价屏蔽措施效果都有重要的意义^[11]。J.Stewart等^[12]为研究宇航员在宇宙射线中生物学效应最强成分HZE粒子受照后的基因表达谱的改变, 利用基因芯片技术分析经过HZE粒子照射的人甲状腺上皮细胞基因表达谱改变, 发现在10、20cGy铁离子照射下差异表达基因分别有196、610个, 其中一些基因已证实在光子辐射细胞活化中发挥着非常重要的作用。

1.3 筛选与射频辐射相关的基因

射频辐射对生物体的非热效应及其作用机制是生物电磁学的研究热点, 如前所述, 基因芯片技术是研究基因与基因之间相互作用、基因群综合调控维持生命表型的机制的最佳手段, 也是目前研究射频辐射机制的有效手段。张淑芝等^[13]应用基因芯片技术分析1.8GHz射频电磁场辐照后的大鼠皮层和海马神经元细胞, 筛选出34个差异表达基因, 占所检基因总数的3.4%, 其中表达上调的基因有24个, 表达下调的基因有10个。在表达上调的基因中有3个与离子通道有关的基因, 3个与G蛋白信号通路有关的基因, 4个与MAPK通路有关的基因, 6个微管相关蛋白基因, 2个炎性反应因子, 1个与蛋白质运输相关的基因, 1个谷胺酸合成酶1基因, 2个与神经髓鞘有关的基因, 1个与突触有关的基因, 1个神经细胞粘附分子。在表达下调的基因中有与转录调节有关的基因, 有与氧化还原有关的基因, G蛋白偶联受体有关的基因, B型-γ氨基丁酸受体基因。

1.4 揭示与微波辐射相关的基因改变

微波辐射可引起培养细胞的氧化应激反应, 诱导细胞损伤或凋亡, 细胞的氧化应激和凋亡反应涉及到细胞内多基因的参与, 传统的研究方法仅仅从一个基因、一个蛋白入手研究其作用, 所获得的信息往往比较单一, 很难对微波的作用机制有一个全面的了解。通过用基因芯片技术对微波辐射组细胞与正常组细胞在细胞应激和凋亡基因转录水平进行比较研究, 可以发现与微波辐射应激反应有关的基因群, 探讨微波辐射作用的分子机制, 为进一步深入研究微波的生物学效应和预防提供线索。

刘秀红等^[14]应用基因芯片技术对2450MHz微波辐射、未辐射的视网膜色素上皮细胞的mRNA进行检测.微波辐射较未辐射细胞相比有3条与应激相关的基因M31166、L24123、AF039704转录增加, 而与细胞代谢应激有关基因U49869(编码Ubiquitin蛋白, 一种重要的非溶酶体蛋白水解酶)和与细胞增殖有关的基因AF098799(编码核转运子RanBP7)转录降低, 在本试验条件下未检测到与细胞凋亡和与细胞热应激相关的基因转录有显著的差异。杨学森等^[15]采用65mW/cm2 X段微波辐照昆明小鼠20min, 引起热效应损伤, 结果发现辐照后可使海马神经细胞5个基因表达上调; 辐照后24小时差异表达基因增加至30个, 其中上调6个, 下调24个, 这些基因编码应激蛋白、细胞凋亡相关蛋白、信号转导调控因子及效应子、细胞因子、DNA损伤与修复蛋白等。

2 基因芯片技术在放射治疗领域的应用 2.1 测定放疗后细胞基因表达变化

放射治疗是治疗恶性肿瘤的重要手段之一。电离辐射能通过引起各种细胞的DNA断裂抑制细胞的增生。当细胞吸收任何形式的辐射能量后, 射线都可能直接与细胞内的构成部分发生作用, 直接或间接地损伤细胞DNA, 导致细胞死亡。但一些恶性肿瘤细胞由于自我防御机制可以逃避射线杀伤并产生辐射抗性, 严重影响肿瘤的放疗效果。基因芯片技术作为一个能够对组织内基因表达进行研究的高通量和高效率的技术手段, 与目前的放疗技术相结合将会更多地揭示基因之间的内在作用, 能更全面地研究某一病症的相关基因, 使研究更具有目的性、全面性和系统性^[16], 开辟肿瘤治疗研究的新途径。

柳毅等^[17]通过基因芯片技术检测宫颈癌Hela细胞株和诱导的耐放射亚株HelaNR及HelaXR的基因表达谱, 筛选出与宫颈癌放射抵抗相关的DNA损伤修复信号通路差异表达基因, 为宫颈癌放疗耐受的干预及基因放射治疗提供可能的靶点。HelaNR细胞有24个差异表达基因, 其中19个上调, 有5个下调; HelaXR细胞有41个差异表达基因, 其中38个上调, 有3个下调, 并采用western blot和Real-time PCR检测了Hela、HelaNR和HelaXR细胞中GADD45Q和BTG2两个基因的蛋白和mRNA表达情况, 结果显示:在HelaNR和HelaXR细胞中, GADD45Q表达下调, BTG2表达上调, 与基因芯片的结果是一致的。朱小东等^[18]采用基因芯片技术检测不同增殖状态的NE-2细胞DNA损伤修复相关基因表达, 结果显示CNE-2细胞增殖活性最高时相(2Gy连续照射第3天)与最低时相(2Gy连续照射第5天)表达有差异的DNA损伤修复相关基因有6条, 占检测基因总数的5.9%(6/102), 其中细胞增殖活性增高时上调的基因为CDC25A, 下调的基因为DDIT3、GADD45、CDKN1A、BNIP3和FOXO3A。应用相对定量荧光实时PCR技术, 对部分差异表达基因CCNE1、CDC25A、CDKN1A、DDIT3、GADD45和BNIP3进行了mRNA水平的验证, 结果显示实时PCR实验结果与芯片结果具有良好的一致性。姚志强等^[19]采用cDNA芯片技术检测两例胶质母细胞瘤组织在60Gy治疗前和治疗后基因表达情况后发现差异表达基因群中改变最明显的是免疫系统相关基因, 如IGLV1-44、SLP I、CXCL14等, 照射可使其上调。细胞增殖、细胞调亡、细胞周期、DNA修复系统等也有部分基因发生明显变化, 如MLL5上调、POLR2B下调等。这些研究可以更好地阐明放射敏感性差异机理。

2.2 重离子技术与基因芯片技术联合应用的研究

重离子技术, 即把受照射的肿瘤部位置于Bragg峰处, 肿瘤在接受较大剂量照射的同时而其前方正常组织接受较小的辐射剂量。重离子束治疗肿瘤已成为当今最先进的放疗技术。针对辐射诱导的生物学效应, 人们可以利用基因芯片技术构建与辐射相关的寡核苷酸基因芯片排除干扰因素, 进行生物信息学分析^[20]。

Oohira等^[21]利用腺病毒载体构建野生型P53表达质粒, 结合重离子技术, 用基因芯片相关技术研究单独使用P53基因, 单独重离子辐射治疗和两者联合使用对食道癌鳞状细胞(SCC)的生长和凋亡的影响, 结果发现P53基因可增强肿瘤细胞对重离子辐射的敏感性。P53基因和重离子辐照联合使用比单用其中之一, 具有更显著的肿瘤抑制作用。

3 展望

近年来基因芯片技术在辐射分子生物学领域得到了广泛关注和应用, 并取得了重要的进展。由于目前还不能实现对真实的空间辐射环境的生物效应进行研究, 因此, 需要充分利用地面模拟装置, 模拟空间复杂辐射环境, 通过恰当的动物、细胞模型来阐明规律, 从亚细胞结构和信号分子调节网络层面阐述机理, 结合基因芯片技术进一步阐释基因突变、细胞凋亡等辐射生物学效应, 为空间辐射健康危害评价和防护措施的研究提供重要依据, 为航天员的辐射安全的医学防护提出新思路。此外, 利用基因芯片技术结合重离子技术研究肿瘤细胞辐照前后的生物学效应, 必将成为辐射治疗方面的革命性的新方法和新工具。