中国辐射卫生  2011, Vol. 20 Issue (2): 137-139  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2011.02.011

引用本文 

段志凯, 刘建功, 郭万龙, 张淑贤. 电离辐射诱导人外周血线粒体DNA4977 bp缺失的初步定量PCR分析[J]. 中国辐射卫生, 2011, 20(2): 137-139. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2011.02.011.
DUAN Zhi-kai, LIU Jian-gong, GUO Wan-long, et al. Primary Quantitative Analysis of the mtDNA4977bp Deletion Induced by Ionizing Radiation in Human Peripheral Blood Using real-time PCR[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2011, 20(2): 137-139. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2011.02.011.

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收稿日期：2010-12-10
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电离辐射诱导人外周血线粒体DNA4977 bp缺失的初步定量PCR分析
段志凯 , 刘建功 , 郭万龙 , 张淑贤     
中国辐射防护研究院, 山西太原 030006
收稿日期：2010-12-10
作者简介：段志凯(1970~), 男, 硕士, 研究员, 主要从事放射医学与辐射防护工作.
摘要：目的 观察不同剂量γ射线对人外周血线粒体DNA4977bp缺失的影响, 探索线粒体DNA4977bp缺失作为生物剂量计的可行性。方法 采集3名健康人外周血进行离体照射, 利用荧光定量PCR技术, 检测射线照射后外周血细胞中线粒体DNA4977bp缺失的发生情况。结果 发现0~8Gy范围内, 随着剂量的增加mtDNA49bp相对缺失量有增加的趋势, 使用Origin7.5统计软件进行拟合, 建立了以人血细胞mtDNA4977bp缺失为指标的剂量效应关系曲线方程Y=1.2693+1.0660X+0.0198X2。结论 不同剂量γ射线对人外周血线粒体DNA4977bp缺失的有一定的影响, 且线粒体DNA4977bp与受照剂量有一定的效应关系, 因此, 线粒体DNA4977bp缺失在生物剂量估算中具有潜在的应用价值。
关键词：人外周血    mtDNA4977缺失    电离辐射    实时荧光定量PCR    
Primary Quantitative Analysis of the mtDNA4977bp Deletion Induced by Ionizing Radiation in Human Peripheral Blood Using real-time PCR
DUAN Zhi-kai , LIU Jian-gong , GUO Wan-long , et al     
China Institute for Radiation Protection, Taiyuan 030006 China
Abstract: Objective To observe the influence of mtDNA4977bp deletion induced by different dose of γ ray in human peripheral blood in order to explore the feasibility of mtDNA4977bp deletion as biodosimeter. Methods Human peripheral blood samples were collected from three healthy donors and irradiated by γ ray, MtDNA4977bp deletion was detected by real-time PCR. Results It indicated that that from the range of 0~8 Gy, the relationship between mtDNA4977bp deletion and irradiation dose represents certain curvilinear correlation (Y=1.2693+1.0660X+0.0198X2). Conclusion We find that γ ray has influence on the mtDNA4977bp deletion, so it may be an important biodosmeter in future.
Key words: Human Peripheral Blood    MtDNA4977bp Deletion    Ionizing Radiation    Real-time PCR    

目前国内外普遍最实用的生物剂量计估算方法当属染色体畸变[1]，但是染色体畸变作为生物剂量计估算方法也有其明显的缺点。因此，建立能够快速准确和高通量的估算生物剂量的分子生物学方法已成当今研究的热点。

线粒体(mitochondrial DNA，mtDNA)是独立于核基因组，具有自我复制能力的细胞器。由于缺少组蛋白和非组蛋白的保护、缺乏有效的基因修复系统以及线粒体自身的特点使之容易受到外界因子的损伤而发生突变[2]，其中以线粒体DNA4977bp缺失最为常见[3-5]。人mtDNA全长为16569bp，缺失位于mtDNA序列的两个13bp正向重复序列5'-ACCTCCCTCACCA-3’，即8 470~8 482和13 447~13 459之间。研究表明，辐射可诱导该缺失的产生[6, 7]，提示mtDNA4977bp缺失可能是辐射损伤的标志之一。

1 材料和方法 1.1 血液样本采集

选择年龄在24~29岁之间、近期无放射性物质接触史的健康男性为供血者，无菌条件下静脉取血每人10ml，分装到10个EDTA抗凝管中，备用。

1.2 照射和培养

中国辐射防护研究院附属医院60Co治疗机进行γ射线照射，照射剂量率为0. 316Gy/min，照射剂量分别为0，0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4. 0，5. 0，6. 0，8. 0Gy，误差范围± 0. 3%，然后37℃静置培养2h。

1.3 白细胞mtDNA的分离提取

在照射后2h收集样本，每个剂量点的样本体积为1mL，严格按照血液mtDNA提取试剂盒(上海杰美基因公司)说明书的操作步骤进行mtDNA的提取，得到的样品溶于20μL体积溶液中，mtDNA样品经核酸定量仪测定其浓度及纯度。

1.4 实时定量PCR引物以及反应体系

委托大连宝生物公司设计、合成针对人mtDNA缺失区域两端基因序列的特异引物见表 1。

表 1 设计针对mtDNA缺失区域和ND1内参的引物序列

ND1在哺乳动物各类组织内转录水平较为恒定，受辐射影响小[8, 9]，故选ND1为内参对照基因进行3次独立重复荧光定量PCR扩增反应，反应体系见表 2。

表 2 荧光定量PCR反应体系

反应条件:

1.5 相对标准曲线法实时定量PCR检测方案的建立

将标准品进行1:2梯度稀释，得到的扩增结果绘制出标准曲线，将受照样品的扩增结果带入标准曲线求出mtDNA缺失和内参的相对量。

1.6 电离辐射后血液中mtDNA4977bp缺失变化规律的研究

将不同照射剂量的mtDNA样本与梯度稀释的标准品在同一块PCR反应板上进行定量PCR反应。计算每个样本的mtDNA缺失的相对量，进行统计学分析。

2 结果 2.1 核酸定量测定

本研究中制备的mtDNA样品经ND2000微量核酸定量仪测定OD260/OD280，浓度见表 3。

表 3 不同剂量提取获得的mtDNA浓度
2.2 标准曲线

将标准品进行梯度稀释作为反应模板，分别扩增目的基因与内参基因，得到两个基因的标准曲线如图 1，斜率M值大于0. 1，表明两个基因的扩增效率有所差异，只能使用双标准曲线法进行定量检测。

图 1 目的基因与内参基因标准曲线
2.3 溶解曲线

实时定量PCR反应后添加一个DNA双链溶解的程序，计算机分析系统自动给出溶解曲线，如图 2所示目的基因与内参基因均有惟一峰，表明PCR扩增反应没有非特异产物。

图 2 目的基因与内参基因溶解曲线
2.4 相对表达浓度

计算每个剂量点样本的mtDNA4977/ ND1相对量，结果见表 4。

2.5 辐照后mtDNA4977缺失的剂量-效应关系

将不同剂量点的PCR扩增产物相对浓度，通过Origin分析软件拟合得到剂量-效应关系见图 3及图 4。

图 3 0~8Gy线粒体DNA4977bp缺失

表 4 各个剂量点的PCR扩增产物相对浓度
3 讨论

本研究的基本原理在mtDNA缺失片段的两侧设计引物，通过定量PCR反应，使得未缺失的mtDNA由于产物太大而不能产生PCR产物，而只有4977bp缺失的mtDNA才会扩增出PCR产物。Prasanna[10]等应用原位PCR方法分析淋巴细胞的mtDNA4977bP缺失，该方法所需的外周血量较大而使得其实用性受到限制。后来，封江彬[11]等采取巢式PCR的方法使用少量的血液样品便可有效扩增mtDNA4977bp缺失，但是其缺点在于不能方便、快速进行定量研究。

图 4 0~8Gy线粒体DNA4977bp缺失

目前，荧光PCR技术的敏感性已经提高到可以对样品中单个拷贝基因进行定量，该方法具有灵敏、特异，而且测定用的实时荧光PCR仪自动化程度很高。本研究通过对mtDNA4977bp的缺失进行实时荧光PCR定量检测，得到了不同剂量水平下人血mtDNA4977bp的相对缺失量。使用Origin7. 5统计软件进行拟合，建立了以人血细胞mtDNA4977bp缺失为指标的剂量效应关系直线方程Y = 1. 1189 + 1. 2158X和曲线方程Y = 1. 2693 + 1. 0660X + 0. 0198X2。由于大剂量受照生物剂量估算的剂量效应关系拟合以二次多项式较为合适，通过综合分析认为0~8Gy曲线方程Y = 1. 2693 + 1. 0660X + 0. 0198X2更加合理，符合实际情况。

采用实时荧光定量PCR检测技术，mtDNA4977bp的缺失与受照的剂量效应关系在排除遗传背景、本底变异、年龄和吸烟等因素的影响后，有望用于大群体受照的快速生物剂量估算。

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