电离辐射诱发的基因表达变化与被照射细胞及生物体的生物学反应密切相关。其中辐射诱发GADD45A基因的剂量-效应关系尤为关注。GADD45A基因为生长阻滞和DNA损伤基因, 其编码一个约18kD大小的酸性蛋白[1]。该蛋白是一个DNA损伤诱导蛋白, 在多种损伤因素如:电离辐射、紫外线照射、甲磺酸甲脂、二甲基苯蒽、血清饥饿、各种化疗药物以及细胞密度等的作用下, 可以p53依赖和非依赖的方式表达上调。国内外学者的相关研究多集中于急性照射后GADD45A基因的表达变化及其剂量效应关系。而在长期慢性小剂量照射的环境中, 辐射对生物体的影响已引起广泛关注。因此, 本研究利用实时荧光定量PCR方法, 以β-actin作为内参基因, 通过双标准曲线法研究慢性累积照射后SD大鼠外周血GADD45A基因的表达变化, 为寻找慢性照射条件下辐射损伤的早期诊断标志物提供实验依据。
1 实验材料与方法 1.1 实验动物本实验采用SD大鼠, 雄性, 购自军事医学科学研究院。
1.2 主要试剂及仪器RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒(TIANGEN公司, 北京); PrimeScriptTM RT reagent Kit(宝生物工程有限公司, 大连); 实时荧光定量PCR试剂SYBR® Premix Ex TaqTM(Perfect Real Time) (宝生物工程有限公司, 大连); Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪(Corbett Life Science公司, 澳大利亚)。
1.3 实验方法 1.3.1 SD大鼠的培养与照射将体重为150~180 g的SD大鼠分为11个剂量组, 每组10只。于19~26℃, 40%~70%的湿度下培养, 待大鼠培养至200~250 g(约8~9周龄), 分别经0.05、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1、2、3、4和5 Gy 137Cs γ射线慢性累积照射。剂量率为0.353mGy/min。照射实验在8周内完成。
1.3.2 SD大鼠外周血的采集取照射后的SD大鼠, 禁食2h后, 利用10%水合氯醛0.4ml/100g腹腔注射麻醉大鼠, 腹主动脉采血1ml于EDTAK2抗凝管中, 期间柔和摇动以防凝血。
1.3.3 外周血总RNA的提取及cDNA的合成血液总RNA的提取采用TIANGEN公司RNAprep pure血液总RNA提取试剂盒, 获得的RNA直接用于cDNA的合成。cDNA的合成利用宝生物工程有限公司反转录试剂盒PrimeScriptTM RT reagent Kit完成, cDNA合成的反转录反应体系如表 1。反转录反应条件: 37℃, 15 min(反转录反应) 85℃, 5sec(反转录酶的失活反应)。
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表 1 SD大鼠血液cDNA的合成 |
本实验目的基因为大鼠GADD45A基因, 所选内参基因为大鼠β-actin基因。实时荧光定量PCR的引物序列设计如表 2、3, 序列合成委托宝生物工程有限公司合成。
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表 2 GADD45A基因的实时荧光定量PCR引物设计 |
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表 3 β-actin基因的实时荧光定量PCR引物设计 |
GADD45A基因的实时荧光定量PCR检测GADD45A基因的实时荧光定量PCR检测分析利用双标准曲线法, 采用Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪完成, 反应试剂采用宝生物工程有限公司SYBR® Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time)试剂盒, 反应体系如表 4。
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表 4 实时荧光定量PCR检测反应体系 |
实时荧光定量PCR反应条件:
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实时荧光定量PCR采用双标准曲线法, 以看家基因β-actin为内参, 相对定量照射后样品靶基因的表达水平, 即以对照组(未照射组)标准样品的靶基因表达量为1, 照射样品靶基因定量均为标准品的n倍。数据采用Origin 7.5软件进行数据统计分析与作图。
2 实验结果 2.1 RNA质量检测本实验提取的RNA样品经分光光度法检测, OD260/280比值大于1.8, 表明提取的总RNA完整, 无降解, 可用于进一步实验。
2.2 SYBR Green荧光定量PCR扩增特异性验证溶解曲线分析显示β-actin、GADD45A基因均为单峰(如图 1、2), 表明荧光定量PCR扩增特异性较好。
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图 1 GADD45A基因的溶解曲线 |
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图 2 β-actin基因的溶解曲线 |
电离辐射后大鼠GADD45A基因及内参基因β-actin的扩增曲线如图 3、4.由荧光定量PCR扩增曲线可知, 在第10个循环后GADD45A基因进入指数扩增期间, 而内参基因β-actin在第5个循环后便进入了指数增长期。电离辐射对大鼠外周血GADD45A基因表达的影响与照射剂量关系见图 5。如图, 各剂量组与对照组相比, 其基因表达均有显著变化, 整体上随照射剂量的增加, 基因表达量具有一定的上升趋势。其中, 0.05Gy剂量组与对照组相比表达增高, 随着照射剂量的增加及照射时间的延长, GADD45A基因的相对表达量有所回落, 当剂量达0.4Gy后该基因表达减至最低点。之后随照射剂量的增大, 各剂量组与对照组相比具有不同程度的升高, 4Gy照射组的GADD45A基因表达增强最显著。
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图 3 GADD45A基因的扩增曲线 |
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图 4 β-actin基因的扩增曲线 |
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图 5 大鼠外周血GADD45A基因表达与照射剂量的关系 |
电离辐射可导致DNA损伤, 进而诱导细胞周期的G1期阻滞, 使受损DNA得到修复的机会, 从而进入下一个细胞周期, 而未修复的细胞则失去活力而被清除。以此机制维持细胞基因组的稳定性, 减少肿瘤发生。目前研究认为野生型P53蛋白在G1-S期过渡中起关键作用。电离辐射可激活P53基因, 其蛋白产物P53蛋白作为转录因子调控下游基因(GADD45, CIPUWAF2, Mdm2)的转录, 并表达相应蛋白产物(GADD45, P21, Mdm2)[2]。因此, 作为P53基因的下游基因GADD45A参与了阻止细胞从G1期进入S期, 导致G1期阻滞。除此之外, GADD45A基因还参与了细胞的生长抑制和DNA的损伤诱导, 在辐射导致的细胞凋亡及DNA修复中发挥重要作用。
国内外研究表明辐射可诱导GADD45A基因表达发生改变。Grace等[3]采用实时定量PCR技术检测人正常外周全血细胞照射后GADD45基因的表达变化, 发现其在1-3Gy剂量范围内表达与受照剂量呈线性关系。傅春玲等[4]应用RT - PCR定量分析不同剂量X射线照射对人外周血淋巴细胞GADD45基因表达的影响, 结果表明, 在1~5 Gy范围内, 人体外周血淋巴细胞GADD45基因的表达与照射剂量呈指数相关。Fornace等[5]对人成髓细胞性白血病细胞系ML-1细胞的研究表明, 人成髓细胞性白血病细胞系ML-1细胞在2~50cGy剂量范围内有线性剂量效应关系。Gajdusek等[6]用RT-PCR技术研究发现, γ射线照射小鼠内皮细胞后, 其GADD45A基因在5~15 Gy范围内呈剂量依赖性增加, 在照射后8 h内呈时间依赖性增加。徐丽昕等[7]研究X射线照射后GADD45基因的表达变化, 结果表明人外周血经X射线照射后, GADD45基因在转录水平表达呈剂量性增强, 照射后4h达峰值, 以后开始下降, 但在24h仍未恢复到初始水平。
上述研究结果均证实在急性照射条件下, GADD45A基因的表达呈剂量依赖性增高, 但剂量反应关系及照后的时间效应关系在不同的细胞系中存在差异。关于慢性长期照射条件下GADD45A基因的表达研究鲜有报道。本研究采用SD大鼠, 从整体水平上研究慢性照射后外周血GADD45A基因的表达变化。结果发现经不同剂量γ射线慢性照射后, 大鼠外周血中GADD45A mRNA表达水平总体上是增高的, 与急性照射条件下GADD45A基因表达改变的实验结果趋势一致。
经不同剂量慢性长期累积照射后, 受损细胞通过一定通路使P53蛋白表达持续增高, 活性增加, 进而诱导GADD45A基因表达亦持续增高。在此期间, GADD45A基因作为P53基因的下游基因可能会在DNA修复与细胞周期G1/S期检查点之间起沟通连接作用[8]。这种作用是通过刺激受损DNA的切除修复以及抑制DNA受损细胞进入S期实现的[4]。通过上述的周期调控机制, 保证了S期DNA复制的忠实性。
国内关于电离辐射诱导GADD45A基因表达变化的研究多采用半定量PCR方法。本研究所采用的实时荧光定量PCR技术是一种新的PCR方法, 与传统的PCR法相比, 具有无需进行PCR后处理, 可对DNA扩增进行实时监测。由于其快速、灵敏等特点, 目前已广泛应用于各种病原体的监测[9, 10]。本研究采用SYBR GreenⅠ嵌合荧光法, 即在反应体系中加入与双链DNA结合便可发出荧光的荧光染料SYBR GreenⅠ, 它能结合于DNA小沟而发出荧光。在PCR反应体系中, 加入过量SYBR GreenⅠ荧光染料, 特异性地掺入DNA双链后发射荧光信号, 而不掺入链中的SYBR GreenⅠ染料分子不会发射任何荧光信号, 从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。它的最大优点是能用于任何模板的任何一对引物。
综上所述, 本实验证实在不同剂量慢性累积照射情况下, 细胞GADD45A基因的表达持续增高, 与急性照射后该基因的反应一致。提示GADD45A基因表达产物有望成为慢性累积照射条件下辐射损伤的早期诊断标志物。此结果还需在长期接受慢性照射的相关人员中得以进一步的证实。
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