新生小牛血清是生物制品生产中一种重要原材料, 是细胞培养中不可缺少的营养成分。由于新生小牛自身健康因素及在成品小牛血清生产过程中极易造成血清污染, 病毒、大肠杆菌噬菌体及细菌内毒素等都会随之产生。尽管经过终端为0.1μm的多级过滤系统过滤, 达到了去除细菌和支原体的目的, 但病毒、细菌内毒素、大肠杆菌噬菌体等外源因子仍无法去除, 用存在上述外源因子的新生小牛血清生产的生物制品会对人体健康造成极大危害。笔者着重介绍了采用不同剂量辐照小牛血清的灭菌效果, 并对各项生物指标的影响做了初步探讨。

1 材料和方法 1.1 材料

初制小牛血清由沈阳辉山金辉畜牧生物有限公司和哈尔滨维远生物工程有限公司提供; 大肠杆菌C—3000由中国药品生物制品检定所提供; 牛腹泻病毒(BA)株, 由中国兽药监察所提供。鲎试剂, 由辽宁省药检所提供。胰酶及DMEM培养基均为美国GIBCO公司产品。

1.2 样品及编号

初制小牛血清经过终端为0.1 μm的多级过滤系统过滤后获得精制小牛血清, 取经检测牛腹泻病毒阳性、大肠杆菌噬菌体阳性、细菌内毒素>10EU/ml的10批精制小牛血清作为样品, 用⁶⁰Coγ射线照射。样品编号为1~10号, 每个编号取1个样品, 分成4份, 其中1份留作对照, 其他3份按5 kGy、10 kGy、15 kGy三个剂量进行照射, 辐照样品编号分别为1₅~10₅、1₁₀~10₁₀、1₁₅~10₁₅。

1.3 静态辐照方式

血清样品由辽宁钴源辐照中心进行照射, 采用单栅板源照射, ⁶⁰Coγ源活度为7.4PBq(20万Ci)。将小牛血清样品摆放在辐照源的两侧, 吸收剂量分别为5 kGy、10 kGy、15 kGy。

1.4 检测内容与方法 1.4.1

牛腹泻病毒检测用直接病变法, 制备牛肾第六代细胞接种到96孔培养板中, 细胞浓度为10⁴/ml, 每孔0.1 ml, 37 ℃培养2 h, 分别加入等量的小牛血清, 同时设立阴性和阳性对照, 37 ℃培养48~72 h镜下观察结果。结果判断, 细胞感染病毒后出现病变反应为阳性, 无病变为阴性。

1.4.2

大肠杆菌噬菌体检测^[1]用增殖法, 10倍稀释的小牛血清分别加2 h宿主菌培养物1 ml, 36 ℃培养18 h, 滤过液点于宿主菌覆盖的琼脂表面。36 ℃培养18 h后检查噬菌斑的形成。结果判定, 无噬菌斑为阴性, 有噬菌斑为阳性。

1.4.3 细菌内毒素含量检测

用鲎试剂法检测, 小牛血清细菌内毒素含量 < 10 EU/ml为阴性, >10 EU/ml为阳性。d细胞倍增时间测定^[2] :将SP2/0骨髓瘤细胞按10⁵ /ml接种于含有10%待检小牛血清的培养基中适应培养1周, 隔天传代1次, 以10⁴ /ml的浓度接种到24孔培养板中, 每天计数1孔, 到细胞全部死亡。用细胞动态测定过程中细胞数峰值前一天所计得的数(x), 达到该数的倍增次数(y)及所需时间(t)来计算细胞培增时间。即:DT=t/y, 其中y=log2^x。

2 结果与分析 2.1 生物指标比较

照射吸收剂量分别为5 kGy、10 kGy、15 kGy时, 血清中牛腹泻病毒、大肠杆菌噬菌体及细菌内毒素含量检测结果见表 1。

由表 1可知, 小牛血清中有牛腹泻病毒、大肠杆菌噬菌体和细菌内毒素存在。当照射吸收剂量为5kGy时细菌内毒素>10EU/ml, 部分牛腹泻病毒、大肠杆菌噬菌体仍呈阳性。而当吸收剂量增加到10 kGy、15 kGy时, 牛腹泻病毒、大肠杆菌噬菌体已全部呈阴性, 细菌内毒素仍>10EU/ml。

2.2 细胞倍增时间比较

由上述各项生物指标检测试验结果得知, 10kGy吸收剂量照射的小牛血清中除细菌内毒素外的外源因子都被去除掉。因此我们选择了10批未照射和照射10 kGy的小牛血清进行细胞倍增时间影响的测定, 结果见表 2。由表 2可知, 两组DT均数分别为16.08及16.25, P>0.05, 两组均数间差异无统计学意义。

3 讨论

细胞倍增时间是衡量小牛血清细胞质量优劣的一项重要指标, 我们用10批精制小牛血清进行的细胞倍增时间检测证明, 经照射10 kGy和未照射的小牛血清差异无统计学意义, 对小牛血清质量无不良影响。

通过本实验可以得出这样的结论, 当照射的吸收剂量达到10 kGy时, 就可以全部杀灭牛腹泻病毒和大肠杆菌噬菌体等外源因子。当照射的吸收剂量达到15 kGy时, 细菌内毒素仍然存在, 这可能是由于它的成分是脂多糖或照射剂量不够, 这些问题有待进一步探讨。由于新生小牛血清还有多种不为人知的其他病毒, 会对人体健康造成潜在威胁, 在新版《药典》中也增加了血清病毒的检测种类, 因此用辐照灭菌方法去除血清中存在的病毒等外源因子是非常有意义的。