ELAC2基因是2001年由美国科学家Tavtigian新发现的一种导致家族性前列腺癌的易感基因, 位于人类17号染色体长臂[1]。人类ELAC2基因由24个外显子组成, 编码由826个氨基酸组成的一种未知蛋白质, ELAC2家族蛋白的一级结构包含了金属-β-内酰胺酶的所有5个特征性保守序列。研究发现ELAC2蛋白一级结构和PSO2/SNM1/Artemis蛋白家族共享某些相似的氨基酸序列[2]。其中PSO2/SNM1是一种DNA链间交链修复蛋白[3, 4], Artemis蛋白是一种DNA双链断裂修复和V(D)J重组修复蛋白[5]。因此我们推测ELAC2基因有可能参与DNA损伤修复, 所以, 本研究旨在将ELAC2基因转染到乳癌细胞MCF-7中并观察该基因对细胞辐射敏感性的影响以及对辐射损伤修复蛋白的表达调控。
1 材料和方法 1.1 细胞MCF-7细胞株购自美国细胞收藏中心(Americal Type Culture Collection, ATCC), 由本实验室培养保存。质粒pcDNA3-ELAC2和空载体pcDNA3由本实验室构建、保藏。
1.2 试剂与仪器DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)培养基、小牛血清购自Gibaco公司; TrizolReagent购自美国Invitrogen公司; DNA marker-D、逆转录试剂盒购自加拿大Bio Basic公司; 细胞IP裂解液、SDS-PAGE上样缓冲液以及Tris-HCl购自碧云天公司; BCA蛋白定量试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司; PCR反应试剂盒以及蛋白质marker购自美国Promega公司; 鼠抗人FEN-1(B-4)单克隆抗体、羊抗人MGMT(C-20)多克隆抗体、鼠抗人Ku-70(A-9)单克隆抗体、羊抗人MRE11(C-16)多克隆抗体、兔抗人ELAC2多克隆抗体均购自美国Santa Cruz公司。低温高速离心机(德国Eppendorf公司); MP3电泳仪(美国Bio-Rad公司)。
1.3 细胞培养所有未转染的细胞在含10%小牛血清DM EM培养液中培养, 转染空载体和ELAC2基因的细胞在含G4 18的DMEM培养液中培养, 置于37℃, 5%CO2培养箱中培养。
1.4 细胞转染转染前将细胞接种到6孔板中, 每孔2×105个细胞。待细胞汇合度达到70%~80%, 采用脂质体法, 用Lipofectamine 2000试剂将重组质粒pcDNA3-ELAC2转染至MCF-7细胞中, 同时设置阴性对照组, 空载体pcDNA3组。基因转染6小时后换成含10%小牛血清的DMEM培养液培养, 24 h后用含有G418的DMEM培养液筛选2周。待长出阳性克隆后, 挑取克隆, 扩大培养, 收集并冻存细胞。
1.5 集落形成法将细胞制成单细胞悬液作梯度稀释, 接种于含4 ml培养液的60 mm培养皿内, 24 h后取出细胞接受0、0.5、1、2、4、6 Gy的X射线照射。继续培养至14d至长出肉眼可见的小克隆, Giemsa染色后于显微镜下计数大于50个细胞的克隆数目, 计算克隆形成率和存活分数。克隆形成率=克隆数/接种细胞数×100%, 存活分数=受照射细胞的克隆形成率/对照组细胞克隆形成率×100%, 以存活分数的对数为Y轴, 照射剂量为X轴, 描绘剂量-效应曲线。
1.6 RT-PCR法将收集的细胞用Trizol抽提总RNA, 用逆转录试剂盒将细胞总RNA中的mRNA逆转录成cDNA, PCR扩增, 琼脂糖凝胶电泳检测ELAC2基因的mRNA表达。
1.7 Westernblot法收集的细胞用裂解液充分裂解, SDSPAG E电泳, 转膜, 加入一抗孵育, 以PBSTween20溶液振摇洗涤3次, 加入二抗孵育, 再洗涤3次, 将膜取出用等体积BeyoECLA液和B液荧光检测试剂处理后于暗室中曝光、显影、定影成像。
1.8 统计处理数据以均数±标准差(x±s)表示, 采用SPSS1310(Statistical Package for Social Science 1310)软件进行统计分析, P＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 ELAC2基因稳定转染结果验证如图 1所示, 转染ELAC2基因的细胞MCF-7/ELAC2, 与对照细胞MCF-7和MCF-7/pcDNA3相比, MCF-7/ELAC2细胞mRNA表达水平(图 1A)和蛋白表达水平(图 1B)都明显增高。以上结果说明重组质粒pcDNA3-ELAC2构建成功并顺利导入乳腺癌细胞MCF-7中, 且ELAC2能在细胞MCF-7/ELAC2中高效表达。
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图 1 (A) RT-PCR法检测ELAC2基因mRNA表达; (B)Western Blot法检测ELAC2基因蛋白表达 (1:MCF-7;2:MCF-7/pcDNA3;3:MCF-7/ELAC2)。 |
实验中我们观察到, 细胞接受照射后, 同一剂量下对照细胞MCF-7和MCF-7/pcDNA3形成的细胞克隆数差别不大, 而MCF-7/ELAC2细胞形成的克隆数明显降低。从表 1可见, 0.5 Gy的X射线照射, 对照细胞MCF-7和MCF-7/pcDNA3的存活分数分别为87.5%和89.0%, 而MCF-7/ELAC2细胞的存活分数降低, 为75.1%;2 Gy的X射线照射, 对照细胞MCF-7和MCF-7/ pcDNA3的存活分数分别为46.9%和50.6%, 而MCF-7/ELAC2细胞的存活分数下降为34.3%, 与对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)。从剂量效应曲线图 2可见, ELAC2基因高表达使细胞存活曲线左移, 细胞的辐射敏感性增高。
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表 1 细胞接受不同剂量X射线照射后的存活分数(%) |
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图 2 ELAC2基因高表达增加MCF-7细胞的辐射敏感性 |
从图 3可见, 照射前, ELAC2基因高表达对MGMT、MRE11、FEN-1和Ku-70的蛋白表达未引起明显变化, 细胞接受5 Gy的X射线照射后, ELAC2基因高表达对MGMT、MRE11、FEN-1和Ku-70的蛋白表达仍无明显影响, 但引起FEN-1蛋白和Ku-70蛋白表达水平明显下降。
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图 3 ELAC2基因对细胞损伤修复蛋白的表达调控 |
哺乳动物中SNM1是酵母PSO2蛋白的同源物质, SNM1蛋白包括SNM1A, SNM1B(Apollo)和SNM1C(Artemis)。研究发现SNM1A和SNM1B在ICL(interstrand crosslink)修复中发挥着重要作用, 将鼠的mSNM1A基因敲除, 鼠和鼠的成纤维细胞对丝裂霉素的敏感性增加1倍, 但对辐射和紫外线的敏感性没有增加[6, 7]。通过RNA干扰降低293T细胞中SNM1B表达, 同样发现, 细胞对丝裂霉素的敏感性增加, 而辐射敏感性没有改变[8]。愈来愈多的研究表明, Artemis在DNA双链断裂修复中起作用, Artemis缺失的细胞系对电离辐射敏感。Artemis能和自磷酸化的DNA-PKcs形成具有核酸外切酶活性的复合物, 使Artemis能打开DNA的发夹式结构, 这在V(D)J重组过程中是相当重要的[9]。
尽管ELAC2蛋白一级结构和PSO2/SNM1/Artemis蛋白家族共享某些相似的氨基酸序列, 然而, 我们提高乳腺癌MCF-7细胞中ELAC2基因的表达, 没有发现ELAC2基因具有类似SNM1/Artemis蛋白损伤修复的功能。相反, ELAC2基因高表达, 细胞的辐射敏感性反而增加。Minagawa A[10]研究发现, 人类ELAC2具有tRNA核酸内切酶活性。Korver[11]发现ELAC2基因在肿瘤细胞Hela中高表达, 将导致细胞周期G2-M期的延迟。我们推测, ELAC2基因可能通过某种机制增加细胞的辐射敏感性。
已知, 细胞的放射敏感性与其DNA损伤修复能力密切相关, MGMT是一种重要的修复蛋白, 是唯一能将鸟嘌呤加和物从DNA上移出的蛋白, 主要修复环境中烷化剂导致的DNA损伤。细胞通过Rad52同源重组方式修复辐射等引起的DNA双链断裂, MRE11属于Rad52家族成员之一, 在非同源性末端连接, 减数分裂期同源重组以及在有丝分裂期维护染色体的稳定性都发挥着重要作用[12]。我们在实验中发现, ELAC2基因高表达对MRE11蛋白和MGMT蛋白的表达影响不明显, 照射前后该蛋白表达未出现明显变化。
FEN-1是一种结构特异性核酸酶, 它在DNA复制和修复过程中都起着重要的作用, 它能识别特定的核酸分叉结构, 并切除含有游离5′末端的单链核酸。在DNA修复中, FEN-1参与了损伤碱基和重组错配的修复过程[13]。Ku-70是一种核蛋白, 在DNA双链断裂修复中发挥着重要作用。细胞具有较高程度的DSB修复能力, 修复方式有两种:以DNA依赖蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase, DNA-PK, 包括Ku80/Ku70异二聚体和DNA-PK催化亚单位DNA-PKCs)为主的非同源性末端连接(DNA nonhomologous end-joining, NHEJ)和以ATM (ataxia-telangiecta sia mutated)为主的同源重组(homologous recombination)修复。其中, 最为重要的是NHEJ, 它与DNA双链断裂后细胞死亡与否直接相关。DNA断裂发生后, ku70/80蛋白异源二聚体对DNA末端具有高度的亲和性, 能识别DNA断裂末端并结合到断裂的DNA末端上、保护游离的DNA末端避免被核酸酶分解, 同时ku蛋白与DNA末端结合即可招募DNA -PK的催化亚单位DNA-PKCs与之结合形成DNA-PK全酶, 进而完成NHEJ修复过程[14]。Wilson CR等[15]研究发现Ku70蛋白和(或)Ku80蛋白含量低的肿瘤细胞对放射线敏感, 肿瘤细胞对放射线敏感性与Ku-70基因表达水平之间存在显著的负相关关系。我们在实验中发现, ELAC2基因高表达使乳腺癌细胞MCF-7中FEN-1蛋白和Ku-70蛋白表达水平下调。
综上所述, ELAC2基因高表达使细胞辐射敏感性增加可能与其引起FEN-1蛋白和Ku-70蛋白表达降低有关, 具体的机制需进一步深入研究。
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