随着无线通讯技术的发展, 使用手机的人越来越多。然而, 手机电磁辐射带来的相关健康问题也越来越引起人们的关注。尽管手机厂商及一些相关的专业组织对手机可能产生的微波辐射效应有着严格的限制, 但这些限制并不那么令人放心。已有研究表明, 现在广泛使用着的低强度、脉冲辐射的通讯微波(主要指手机)可产生轻微的非热生物效应。目前非热生物效应对人体的影响还没有完全确定。这些效应对神经系统、生殖系统、造血系统和内分泌系统等的影响已有相关的报道^[1-5], 但对心血管系统的影响很少有文献报道。动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要病理基础, 而泡沫细胞形成是动脉粥样硬化的主要的病理过程^{[6, 7]}。那么手机电磁辐射是否影响泡沫细胞的形成, 因此本研究通过检测手机辐射对氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞形成的影响, 进一步探讨手机辐射对人体功能的影响。

1 材料与方法 1.1 主要药品和试剂

RPMI一1640培养基和胰蛋白酶为invitrogen公司产品; 人血浆购自衡阳市中心血站; 胆固醇标准品和油红O试剂购自Sigma公司; 其他试剂为国产分析纯。

1.2 主要仪器

手机(型号:Nokia 1100), CP100MX型超速离心机, 1100型高效液相色谱仪, 二氧化碳培养箱。

1.3 低密度脂蛋白的制备、氧化和鉴定

健康人血浆采用序列超速离心法制备低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)。取未加抗凝剂的健康人全血180 ml, 室温下静置2 h, 弃血凝块, 以4 ℃、5 000 r/ min离心30 min, 获血清110 ml, 加入NaN₃ 22.4 mg、10% EDTA 0.56 ml防腐、防氧化。血清在离心机上做序列超速离心。然后4 ℃、42 000 r/ min离心18 h, 吸出上层乳白色液体及次层淡黄色液体; 收集下层液体约130 ml, 用溴化钾调整密度为1.063 g/L, 4 ℃、42 000 r/min离心20 h, 吸出上层黄色液体, 即低密度脂蛋白。

LDL用含10%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid, EDTA)的PBS(phosphate buffered saline, PBS)液4 ℃透析72 h; 再用含200 μmol/LCuSO₄的PBS, 37 ℃温育透析16 h, 进行氧化修饰; 再用含200 μmol/LEDTA的PBS液室温透析20 h, 终止氧化; PBS液4 ℃透析24 h, 充分去除EDTA。过滤除菌, BCA试剂定量蛋白含量, 调蛋白浓度至1 g/L用于实验, 4 ℃保存。LDL的氧化程度通过测定硫代巴比妥酸反应物质(TBARS)的值来确定。

取氧化前后的LDL, 经10%的聚丙烯酰胺凝胶电泳, 0.25%考马斯亮蓝常规染色, 脱色后可见清晰的LDL条带, 同时采用0.5%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.4 巨噬细胞的培养

鼠源性单核巨噬细胞RAW 264.7细胞系购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。细胞用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液, 37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养。培养液中加青霉素和链霉素各1.0×10⁵ U/L。

1.5 泡沫细胞的建立

当细胞生长到60%~70%的融合时, 巨噬细胞在50 mg/L氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein, ox-LDL)中培育48 h, 使细胞转变成泡沫细胞。

1.6 辐射实验

细胞分组后用记号笔在细胞瓶上作好标记。将标记为对照组和氧化低密度脂蛋白组的细胞瓶从培养箱中取出, 稍微拧松瓶盖, 放置于37 ℃的恒温箱中保持温度, 并远离手机放置。将氧化低密度脂蛋白+手机辐射组的细胞瓶从培养箱中取出, 稍微拧松瓶盖按标记分别放于另一个37 ℃的恒温恒温箱中贴近手机处。打开恒温箱的一个门, 将手机调至通话状态, 通话持续15 min。实验从上午8:00开始, 每天上午8:00~下午8:00期间每隔2 h取出细胞瓶进行1次辐射实验。辐射实验结束后将细胞继续放到培养箱中培养。泡沫细胞的建立实验进行48 h, 共进行12次辐射实验。

1.7 油红O染色观察RAW细胞内脂质

将细胞培养于预先放有无菌盖玻片的6孔培养板, 处理结束后, 将盖玻片取出, 用PBS冲洗盖玻片3次, 每次5 min, 50%异丙醇固定1 min, 油红O染色液染色10 min, 蒸馏水冲洗3次, 每次1 min, 苏木素染色5 min, 盐酸乙醇分色返蓝后, 水性封片剂封固, 显微镜下观察并摄像。

1.8 高效液相色谱测定细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量

按以下描述的方法进行。将收获好的细胞用1 mL0.9%NaCl溶液稀释细胞, 冰浴中超声破碎细胞, 工作条件为100 W, 工作时间为5 min, 脉冲时间为20 s。用BCA法测定蛋白含量。将细胞溶解产物分为两份, 一份加入等体积新鲜配制的15% KOH醇溶液, 室温涡旋至细胞溶解产物清亮, 用以获取总胆固醇; 另一份加入等体积新鲜配制的8.9 mmol/L的KOH醇溶液, 置于80 ℃水浴中1h, 用以获得游离胆固醇。分别加入6%三氯乙酸去除蛋白, 再加入等体积的正己烷：异丙醇为4：1(V/V)的混合溶液, 将混合物涡旋5 min; 然后在1 500 r/ min、15 ℃下离心5 min, 收集上层有机相, 在真空干燥机中65 ℃干燥; 在室温中冷却后, 加入100 μL异丙醇：正庚烷：乙晴为35：13：52 (V/V)的混合溶液, 将样品溶解; 活性碳去色素, 超声除气5 min, 1 500 r/ min离心5 min, 收集上清液; 取10 μL进行高效液相色谱分析。采用C18柱, 以异丙醇：正庚烷：乙晴为流动相进行非梯度洗脱, 流速1 mL/min, 柱温保持4 ℃, 在216 nm波长下检测10 min。以峰面积定量胆固醇, 单位为mg/g细胞蛋白; 胆固醇酯经胆固醇酯酶水解, 测总胆固醇量, 总胆固醇量减去游离胆固醇量为胆固醇酯的量, 以mg/g细胞蛋白为单位。

1.9 统计学处理

实验结果均采用均数±标准差表示, 组间差异进行方差分析后, 再用t检验。用SPSS14.0统计软件进行统计学分析, 以P＜0.05为有统计学意义。

2 结果 2.1 手机辐射促进了氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞的形成

如图 1所示:与对照组相比较, 氧化低密度脂蛋白组细胞中有大量的脂滴存在(油红O染色显示为红色), 符合泡沫细胞的形态特征; 而氧化低密度脂蛋白+手机辐射组与氧化低密度脂蛋白组相比细胞中含有更多的脂滴。

2.2 手机辐射对泡沫细胞中脂质含量的影响

高效液相色谱法测定了各实验组细胞内胆固醇和胆固醇酯的含量, 并计算胆固醇脂与总胆固醇的比值, 结果如表 1所示:与对照组相比较, 氧化低密度脂蛋白组细胞中总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂和胆固醇脂与总胆固醇比值显著性增加(P＜0.05), 其中细胞内胆固醇酯与总胆固醇比值＞50%, 符合泡沫细胞的特征, 说明形成了泡沫细胞; 与氧化低密度脂蛋白组相比, 氧化低密度脂蛋白+手机辐射组细胞中总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂和胆固醇脂与总胆固醇比值显著性增加(P＜0.05), 但是胆固醇脂与总胆固醇比值的差异没有统计学意义(P＞0.05)。

3 讨论

手机通过电磁波进行信息传递, 电磁波存在电磁辐射, 而这种辐射在通话时最强, 待机时减小。随着手机用户的增多, 手机电磁辐射对人体健康的影响也越来越受到人们的关注, 到目前为止全球手机用户已经突破35亿, 因此手机辐射对人类健康的影响, 那怕是微小的影响也将成为一个重大的公共卫生问题。对于手机辐射对人体的影响长期以来一直存在争论。到目前为止, 还没有研究能够对手机电磁辐射是否会危害人体健康得出最终的结论。本实验结果表明手机辐射可加速氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞形成, 增加了泡沫细胞中总胆固醇、游离胆固醇、胆固醇脂水平, 使泡沫细胞中脂滴含量增加。

泡沫细胞的形成是动脉粥样硬化重要的病理生理学基础, 而动脉粥样硬化是心脑血管疾病的重要基础。因此我们的结果提示手机电磁辐射可能对心血管系统产生不利的影响。单核细胞来源的巨噬细胞以及平滑肌细胞在内膜下吞噬氧化修饰低密度脂蛋白而形成泡沫细胞^{[6, 7]}。泡沫细胞形成的机制十分复杂, 涉及到很多条信号途径和转运蛋白, 如; 三磷酸腺苷结合盒转运体1(ATP-binding cassette transporter A1, ABCA1)、小凹蛋白、清道夫受体等^[8-10]。电磁辐射到底是通过什么机制促进氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞形成?还有待进一步的实验研究。

总之手机电磁辐射可以加速氧化低密度脂蛋白诱导的泡沫细胞形成, 这些结果提示长时间的暴露于手机电磁辐射中可能会增加患以动脉粥样硬化为基础的心脑血管疾病。因此长时间高频率的使用手机, 手机辐射可能对人体健康产生有害的影响。因而建议使用者在使用手机通话时尽量使用耳机, 以增加手机与人体的接触距离, 尽量减少通话时间, 晚上睡觉后可将手机关闭, 尽量减少不必要的手机辐射。