中国辐射卫生  2010, Vol. 19 Issue (2): 138-139  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.016

引用本文 

石燕, 刘伟, 侯殿俊, 马娅, 乔建维, 卢峰, 商希梅. X射线诱发大鼠淋巴细胞TCR基因突变的剂量-效应关系[J]. 中国辐射卫生, 2010, 19(2): 138-139. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.016.
SHI Yan, LIU Wei, HOU Dian-jun, et al. The Dose-response Relationship of T-cell Receptor Gene Mutation of Rat Peripheral Blood Lymphocytes Induced by X-ray[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2010, 19(2): 138-139. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2010.02.016.

基金项目

山东省自然科学基金(Y2007C151)

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收稿日期：2009-12-02
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X射线诱发大鼠淋巴细胞TCR基因突变的剂量-效应关系
石燕 , 刘伟 , 侯殿俊 , 马娅 , 乔建维 , 卢峰 , 商希梅     
山东省医学科学院放射医学研究所, 山东 济南 250062
收稿日期：2009-12-02
基金项目：山东省自然科学基金(Y2007C151)
作者简介：石燕(1982~), 女, 在读硕士研究生。研究方向:辐射效应.
摘要：目的 探讨X射线诱发大鼠外周血淋巴细胞TCR基因突变的剂量-效应关系。方法 以不同剂量(0~3Gy)的X射线照射新鲜分离的大鼠外周血淋巴细胞, PHA、ConA、IL-2协同刺激培养7d, 流式细胞仪检测TCR突变频率。结果 大鼠淋巴细胞体外培养7d后, TCR突变频率随照射剂量的增加而增加, 二者存在良好的剂量-效应关系, 最佳拟合曲线为二次多项式模式, 回归方程为:TCRMF=1.615+9.979D+1.712D2(F=146.781, P < 0.01, Radj2=0.864)。结论 本研究结果显示:X射线诱发大鼠外周血淋巴细胞TCR基因突变频率与照射剂量间存在良好的剂量-效应关系。
关键词：TCR    剂量-效应关系    生物剂量计    
The Dose-response Relationship of T-cell Receptor Gene Mutation of Rat Peripheral Blood Lymphocytes Induced by X-ray
SHI Yan , LIU Wei , HOU Dian-jun     
Institute of Radiation Medicine, Shandong Academy of Medicine Sciences, Jinan 250062 China
Abstract: Objective To investigate the does-response relationship of T-cell receptor from rat peripheral blood lymphocyte induced by X-ray. Methods Freshly isolated peripheral lymphocytes from rat were irradiated with X-ray ranged from 0 Gy to 3 Gy and cultured with phytohemagglutinin Concanavalin A and interleukin-27days, The mutant frequencies of TCR gene were detected by flow cytometry. Results TCR genes mutation increases with the dose incense in the cultured the rat lymphocytes 7 days and it exists favourable dose-response relationship.Data were found to be fitted out optimal by a quadratic polynomial dose-response modle, which could be described by regression equation:TCRMF=TCRMF=1.615+9.979D+1.712D2 (F=146.781, P < 0.01, Radj2=0.867). Conclusion The favourable dose-response relationship between TCRMF induced by X ray and dose can be found from this study.
Key words: TCR    Dose-response Relationship    Biological Dosimeter    

TCR是T淋巴细胞表面的一种蛋白受体, 由α, β或γ, δ双链组成, 其双链只有与CD3分子结合成复合体后才能发挥生物学作用, 由于功能上的单倍性, 发生在有活性的TCR基因的单个突变即可导致表现型TCR突变体的产生, 因此可通过检测CD3分子的表达情况来判断是否发生突变。TCR突变分析法具有采血量少、检测耗时短、反应灵敏等特点, 已被众多学者用于评估人体辐射损伤的研究[1-3], 结果显示:TCR突变频率与照射剂量之间存在良好的剂量-效应关系。但此技术尚不成熟, 未得到实际应用, 需进一步深入研究。笔者参照Ishioka[4]报道, 采用培养法对分离的大鼠外周血淋巴细胞进行PHA、ConA、IL-2协同刺激培养, 使TCR突变表型在7d内得以表达, 观察突变频率与照射剂量的关系, 以探讨TCR突变技术作为生物剂量计的可行性, 并为进一步深入的研究打下基础。

1 材料和方法 1.1 动物及分组

实验动物为健康Wistar大鼠, 平均体重245.48g, 由山东大学实验动物中心提供; 随机分成对照组和5实验组, 每组8只。

1.2 主要试剂

RPMI-1640培养基为美国GIBCO公司产品; HEPES、2-巯基乙醇、丙酮酸钠由Solarbio公司提供; 重组人白介素-2购自长春长生基因药业股份有限公司; 大鼠淋巴细胞分离液购自天津市津脉基因测绘技术有限公司; 植物凝集素(PHA)购自广州医学工业研究所; 刀豆蛋白(ConA)、异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗大鼠CD4抗体为美国invitrogen公司产品、藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗大鼠CD3抗体及非特异同型对照FITC标记的小鼠IgG2a、PE标记的小鼠IgG3均为美国Sigma公司产品。

1.3 照射条件

采用clinac 23EX医用直线加速器照射, 能量6MeV, 照射距离100cm, 剂量率200cGy/min。照射剂量分别为0、0.5、0.75、1.0、2.0和3.0Gy, 照射过程中使细胞保持在(37 ±1)℃的恒温中。

1.4 普通培养基的制备

由RPMI-1640培养液(含L-谷氨酰胺)、2g/LNaHCO3、25mmol/LHEPES、20%灭活新生牛血清、50μmol/L2-巯基乙醇、1mmol/L丙酮酸钠及适量抗生素组成, pH值7.2。

1.5 淋巴细胞刺激液的制备

无菌取大鼠静脉血, 基础培养基洗涤两次, 按全血:培养液为0.5:4的浓度种于普通培养基中, 同时加入2μg/mlConA和2.5μg/mlPHA, 于37℃、5% CO2培养箱中培养48h, 取上清液作为淋巴细胞刺激液。

1.6 淋巴细胞的分离

无菌取大鼠静脉血各2ml, 肝素抗凝, 加入等量的生理盐水稀释, 后缓慢加入到含有3ml淋巴细胞分离液的刻度离心管中, 2 000r离心15min, 吸取淋巴细胞, RPMI- 1640洗涤两次, 最后加入含普通培养基的12孔板中已备照射。

1.7 细胞照射与培养

按上述照射条件照射, 照后根据细胞数多少调节细胞密度, 同时培养基中加入2μg/mlConA、2.5μg/ mlPHA、100u/mlIL-2、20%淋巴细胞刺激液, 置于37℃、5% CO2浓度的培养箱中培养, 根据生长情况进行换液或传代7d后收集细胞。

1.8 TCR基因突变频率的测定 1.8.1 直接免疫荧光标记抗体

收集细胞, PBS洗涤2次, 调整细胞密度为1 ×107/ml, 各取细胞悬液100μl加入两支试管, 第一支加入异硫氰酸荧光素(FITC)标记的小鼠抗大鼠CD4抗体2.5μl、藻红蛋白(PE)标记的小鼠抗大鼠CD3抗体1.25μl, 第二支FITC标记的小鼠IgG2a、PE标记的小鼠IgG3各10μl作为非特异同型对照; 4℃避光15min, PBS洗涤2次, 最后加入PBS重悬细胞。

1.8.2 流式细胞仪检测

采用BeckmancoulterEPIX-XL型流式细胞仪, 单光子激光光源, 波长495nm。采用双参数模型, 设定淋巴细胞"门", 每支试管样品收集细胞1 ×105个, 按以下公式计算TCR突变频率(×10-4):

式中:CD3- CD4+为TCR基因突变细胞表型, CD3+CD4+为正常细胞表型。

1.9 统计学分析

采用SPSS17.0统计软件对TCR突变频率进行t检验, 拟合辐射剂量-效应曲线, 进行回归系数检验和拟合优度检验。

2 结果 2.1 不同剂量X射线诱发大鼠外周血淋巴细胞

TCR基因突变频率的辐射剂量-效应关系由表 1可以看出, 大鼠淋巴细胞经不同剂量X射线(0~3Gy)照射, PHA、ConA、IL-2协同刺激培养7d, TCR基因突变频率随照射剂量的增加而增加, 各剂量组的TCRMF与对照组比较, 差异均有统计学意义(P < 0.05或P < 0.01)。各剂量组间的比较亦具有统计学意义。TCRMF与辐射剂量D之间的相关系数r为0.927, 相关系数检验P < 0.01。这说明TCR突变频率与照射剂量之间存在良好的线性关系。

表 1 不同剂量X射线照射诱发TCR基因突变频率(x±s)
2.2 不同剂量X射线诱发大鼠TCR基因突变的辐射剂量-效应关系曲线的建立

X射线照射诱发大鼠TCR基因突变频率均随照射剂量的增加而增加, 利用SPSS软件进行曲线拟合结果见表 2。相关系数的平方r2是应变量Y的总变异中归因于X的部分, 又称为确定系数, 此即TCRMF的变异可由D来解释的百分数, r2越接近于1, 说明曲线拟合的越好。由于各数学模型的自变量数目不同, 在比较不同模型曲线的拟合度时, Radj2 (校正的拟合指数)比r2准确。从结果上看, 4条曲线均成立(回归系数显著性检验, P值均小于0.01)。根据Radj2, 在0~ 3Gy范围内, 拟合的最佳数学模型为二次多项式。图 1为拟合的最佳数学模型曲线。

表 2 辐射诱发TCRMF的辐射剂量-效应曲线回归方程式、回归系数与拟合度检验

图 1 0~3Gy剂量范围二次多项式模式拟合曲线
3 讨论

随着分子生物学技术的广泛应用, 体细胞基因突变检测技术应用于生物剂量计得以迅速发展, 在一定程度上弥补了物理剂量估算的不足, 用于辐射生物剂量估算的体细胞基因突变包括HPRT基因、GPA基因、TCR基因等。对TCR基因而言, 由核辐射引起的及体外诱发人外周血淋巴细胞TCR基因突变的研究较多, 而对辐射诱发的大鼠淋巴细胞TCR基因突变及其辐射剂量-效应关系的报道较少。本文采用体外培养法对X射线诱发的大鼠TCR基因突变进行研究, 意在观察量-效关系是否存在, 并为进一步研究打下基础。

目前研究结果显示, 大鼠TCR基因突变频率随照射剂量的增加而增加, 突变率可由照射剂量0Gy时的2.68 ×10-4增高到3Gy时的46.65 ×10-4。这与文献[5]报道的人TCR基因突变及文献[6]中小鼠的TCR基因突变与照射剂量间的关系一致。大鼠TCR基因突变频率与照射剂量间存在良好的剂量-效应关系, 利用SPSS软件拟合的最佳数学模型为二次多项式模式: TCRMF=1.615+9.979D+1.712D2, 校正的拟合指数Radj2为0.867。生物剂量计必备的条件之一就是具有较高的灵敏度, 且与照射剂量有较好的相关性, 本研究表明, X射线诱发的TCR突变频率与照射剂量间存在显著的相关性(r=0.927, P < 0.01), 这为后期的深入研究提供了前提。

由于照射射线种类、剂量率、样本量、实验条件等原因, 不同文献报道的一定剂量照射后的TCR突变频率及拟合的量效曲线参数不尽相同, 但TCR基因突变频率均呈照射剂量依赖性增高的趋势。TCR基因突变分析技术作为一种新的潜在的生物剂量测定方法, 还需要大量实验的反复验证才能得以应用。

参考文献
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Vershenya S, Biko J, Drozd V, et al. Dose response for T-cell receptor (TCR) mutants in patients repeatedly treated with 131I for thyroid cancr[J]. Mutat Res, 2004, 548(1-2): 27-33. DOI:10.1016/j.mrfmmm.2003.12.015
[3]
刘长安. γ射线诱发培养淋巴细胞TCR基因突变的剂量-效应关系[J]. 中国工业医学杂志, 2005, 18(1): 23-25. DOI:10.3969/j.issn.1002-221X.2005.01.008
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Ishika N, Umeki S, Hirai Y, et a1. Stimulated rapid expression in vitro for early detection in vivo T-cell receptor mutations induced by radiation exposure[J]. Mutant Res, 1997, 390: 269-282.
[5]
侯殿俊, 马娅, 刘伟, 等. X射线诱发外周血淋巴细胞TCR基因突变研究[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2009, 29(2): 151-154. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2009.02.008
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Kunugita N, Mei N, Goncharova T, et al. Measurement of mutant frequency in T-cell receptor (TCR) gene by flow cytometry after X-irradiation on EL-4 mice lymphoma cells[J]. Toxicol Sci, 2007, 32(4): 377-386. DOI:10.2131/jts.32.377