2. 苏州大学附属第一医院肿瘤放疗科 江苏 苏州 215006
近十余年来, 随着临床胸部肿瘤放疗技术的广泛应用, 因超量照射而发生心脏放射损伤的报道日益增多[1, 2]。研究表明, 人类心脏受照小部分, 心肌细胞可发生凋亡。而成人的心肌细胞是分裂期后细胞, 故放射造成的心肌细胞的直接损伤不是很明显[3], 然而, 在其他样本中可观察到心肌细胞的损害。心肌细胞高剂量照射后可发生间期死亡, 即受照心肌细胞未经分裂就死亡, 有研究者认为, 这种细胞死亡最常见的形式就是细胞凋亡[4]。X射线是临床上肿瘤放射治疗的常用射线之一, 目前对于X射线照射对心肌细胞的直接损伤的研究还较少。由于体外心肌细胞培养消除了体内神经、体液等因素的影响, 有利于研究心肌细胞凋亡的细胞及分子机制。本研究用不同剂量的X射线单剂量照射体外培养的心肌细胞, 观察X射线对心肌细胞活性及凋亡的直接作用。
1 材料与方法 1.1 材料1~3日龄新生spraque-dawley品系乳大鼠, 由苏州大学医学院实验动物中心提供。胎牛血清、DMEM等主要试剂及药品由苏州大学医学院基因室提供。吖啶橙(AO)﹑碘化丙啶(Propidium iodie PI)甲基四唑蓝(MTT):美国Sigma公司产品, 购自上海华美生物技术有限公司。KD -2直线加速器德国西门子公司。
1.2 方法 1.2.1 新生大鼠心肌细胞的培养参考Sadoshima[4]等介绍的方法, 加以改进。即取出生1~3dSD乳鼠(雌雄兼用), 开胸, 取心室肌, 置于无菌PBS液中洗去血细胞, 用0.25%的胰蛋白酶消化分离出心肌细胞, 再用含20%小牛血清的DMEM培养基制成细胞悬液, 贴壁培养1~2h去成纤维细胞后, 按每毫升1 ×106个细胞分装, 于37℃密闭培养。按此法培养的心肌细胞, 于培养后24h即可见部分细胞收缩, 换用含15%小牛血清的DMEM培养液继续培养, 以后每3d换1次液, 取第4天的细胞进行实验研究。
1.2.2 心肌细胞鉴定用抗β-肌球蛋白单克隆抗体免疫荧光染色鉴定培养的乳鼠心肌细胞。实验用原代培养第4天或第二代细胞。
1.2.3 心肌细胞的X射线照射待心肌细胞生长至对数生长期, 贴壁心肌细胞消化制成细胞悬液, 用DMEM培养基将细胞调至3×105/ml, 根据实验设计平均分组, 分别置入5ml离心管, 封管并标明组别, 至西门子KD-2直线加速器下放射, 采用6MV-X射线垂直照射, 放射野面积10cm×10cm大小, 射野源皮距100cm, 剂量率输出DT 200cGy/min, 连续照射至预定辐射剂量, 随后将各照射组心肌细胞带至细胞实验室继续后续实验。正常心肌细胞对照组不照射。
1.2.4 实验分组取培养4d的心肌细胞, 分成下列两组:对照组、放射组。放射组给予不同剂量的X射线(10Gy、20Gy、30Gy、40Gy)处理。对照组换液用无血清DMEM培养基, 放射组换液用含血清DMEM培养基。
1.2.5 实验指标上述两组经37℃培养, 培养不同时间后, 用MTT法测定心肌细胞的活力, 用血生化自动分析仪测定细胞培养基中的LDH浓度, 激光扫描共聚焦显微镜下观察损伤的形态学改变; 用流式细胞仪定量检测心肌细胞的凋亡率。
1.3 统计学处理实验数据以均数±标准差(x±SD)表示, 采用SPSS10.0统计软件包进行各组间单因素方差分析, t检验和χ2检验。
2 结果 2.1 X射线对培养乳鼠心肌细胞的生长抑制效果一定放射剂量范围内, 不同剂量的辐射对培养心肌细胞均有抑制作用, 并呈现剂量与时间依赖趋势。结果见表 1, 其中DT 10Gy、20Gy、30Gy放射心肌细胞的抑制作用不明显(P>0.05), 但随放射剂量的增大, 抑制作用亦明显增高。DT 40Gy抑制作用较明显, 与正常对照组比较有统计学意义(P < 0.05)。
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表 1 不同放射剂量和不同时间下培养心肌细胞生长抑制率 |
在一定放射范围内, X射线对心肌细胞有严重损伤作用, 并随着辐射剂量增大, 时间延长而损伤加重; 不同放射剂量的X射线对心肌细胞LDH释放量有明显影响, 统计学显示有意义(P < 0.05), 见表 2。
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表 2 不同放射剂量和不同时间下培养上清液中心肌细胞LDH释放量 |
在共聚焦显微镜下, 仅有AO着色的为早期凋亡细胞, 仅有PI着色的为坏死细胞, 两种染料双阴性者为正常活细胞, 双阳性者为晚期凋亡细胞(也称继发性坏死细胞)。研究发现, 经DT 40Gy辐射剂量照射心肌细胞24h后, 培养乳鼠心肌细胞发生明显的细胞凋亡形态学改变(如核固缩﹑核碎裂﹑胞内空泡﹑细胞膜完整)。见图 1, 图 2。
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图 1 |
2.4 流式细胞仪检测心肌细胞凋亡
试验结果显示:心肌细胞对X射线有一定抗性, 分别以DT 10Gy、20Gy、40Gy的X射线照射心肌细胞, 第24小时后, 尽管不同剂量的X射线均可诱导心肌细胞凋亡, 但DT 10Gy、20Gy时的凋亡百分率分别为0.93%、1.70%, 较正常对照组变化不明显(P>0.05), 随辐射剂量增大, 心肌细胞凋亡百分率增加。当以DT 40GyX射线照射心肌细胞时, 心肌细胞凋亡达4.03%, 显示有统计学意义(P < 0.05)见表 3。
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表 3 不同剂量X射线照射24h后心肌细胞凋亡百分率 |
在本研究中, 用胰蛋白酶消化分离新生大鼠心脏, 原代培养的心肌细胞在第48h后开始伸展, 显微镜下观察, 细胞均已贴壁, 形态不规则, 呈梭形、菱形、多角形等, 细胞部分细胞聚集团生长, 并可见细胞开始有节律的收缩, 收缩频率变异较大, 每分钟30~150次, 用抗β-肌球蛋白单克隆抗体免疫荧光染色鉴定培养原代乳鼠心肌细胞。阳性率接近95%绿色荧光染色为心肌细胞。可见该研究获得体外培养心肌细胞的模型是稳定可靠的[5]。
MTT在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶作用下, 可以被还原成紫红色的结晶-甲瓒化合物, 其形成量与细胞活力成正比。经溶解后的光密度值(OD值)可作为衡量细胞活力的间接指标。胡舜英[6]等用不同剂量的60Coγ射线单剂量照射体外培养的心肌细胞, 发现60Coγ射线单剂量照射可直接损伤心肌细胞, 降低体外培养的心肌细胞活性, 促进心肌细胞凋亡。本实验结果表明, 一定放射剂量范围内, 不同剂量的辐射对培养心肌细胞均有抑制作用, 并呈现剂量与时间依赖趋势。其中30Gy以下X射线对心肌细胞的抑制作用不明显(P>0.05), 随X射线剂量增大, 抑制作用亦明显增高, 达DT 40Gy抑制作用明显, 与正常对照组相比有统计学意义(P﹤0.05)。提示X射线对心肌的损伤有时间及剂量依赖性, 随时间延长、照射剂量增加, 细胞损伤加重。此外还可能是早中期凋亡细胞内线粒体未完全破坏, 其内的琥珀酸脱氢酶仍具有催化MTT的活性。但从MTT法我们无法得知X射线作用下的心肌细胞是发生了坏死还是晚期凋亡。LDH是存在于心肌细胞的脑浆酶, 当细胞受到损伤时, 细胞膜破裂, 通透性增加, 胞内大量的LDH漏出胞外。因此LDH的释放量与心肌坏死程度呈正相关。本实验表明:心肌细胞LDH释放量随着辐射剂量增大、时间延长而增加; 当放射剂量达40Gy时, 心肌细胞损伤明显, 统计学显示有意义(P < 0.05), 但亦无法确定心肌细胞是发生坏死还是凋亡。AO为一种活性染料, 对活细胞及死细胞均能染色, PI只对失去膜完整性的细胞染色。细胞凋亡早期, 细胞膜结构尚完整, 阳离子染料碘化丙啶(PI)无法进入细胞内。细胞坏死或凋亡晚期胞膜结构被破坏, PI可以进入细胞内使核染色质着红色。因此, 同时使用这两种荧光染料对细胞染色时, 仅有AO着色的为早期凋亡细胞, 仅有PI着色的为坏死细胞, 两种染料双阴性者为正常活细胞, 双阳性者为晚期凋亡细胞(也称继发性坏死细胞)。用AO/PI染色激光扫描共聚焦显微镜观察经DT40GyX射线照射后24h心肌细胞, 可见到坏死及凋亡的心肌细胞。心肌细胞发生明显的凋亡形态学改变:细胞核固缩﹑核碎裂﹑胞内空泡﹑细胞膜完整)。用流式细胞仪检测心肌细胞凋亡结果提示, 随辐射剂量增大, 心肌细胞凋亡百分率增加。心肌细胞凋亡百分率增加。DT 40GyX射线照射时, 心肌细胞凋亡达4.03%, 从而提示高剂量辐射可直接杀伤心肌细胞, 致心肌细胞死亡, 亦可诱发心肌细胞自主死亡—即凋亡。
本实验结果中, 单次大剂量连续照射DT 40Gy, 24h后检测心肌细胞死亡率为19.65%, 流式细胞仪检测其24h后心肌细胞凋亡率仅为3.60%, 提示可能有其他死亡形成, 但也可能是下列原因造成上述差别:①凋亡发生的速度和时间及清除速度因细胞不同而异, 因此某时点测得的凋亡水平并不能反应心肌细胞群体细胞照射诱导凋亡的能力, 即放射线诱导心肌细胞群体细胞中所有能发生凋亡的细胞百分数。②发生凋亡的心肌细胞不断被清除。③不发生凋亡的心肌细胞分裂而同时凋亡的心肌细胞不分裂, 这样使测得的凋亡百分数并未完全反应实际发生水平。
对放射诱导心肌细胞死亡的机制, 一般认为, 放射线导致的细胞死亡是通过放射线的间接作用生成活性氧等有害基因而形成的。放射通过“直接作用”和“间接作用”产生大量自由基而杀伤细胞, 现已证实小量自由基可诱发心肌细胞凋亡, 而大量自由基主要致心肌细胞死亡[7]。可见放射既可直接杀伤心肌细胞致细胞死亡, 又可诱发心肌细胞凋亡。目前认为:①放射诱导细胞DNA双链断裂是放射诱发细胞死亡最重要的原因, 而且放射诱导DNA损伤的量决定细胞的放射敏感性[8]。心肌细胞的放射敏感性高低可能与放射后24h未修复的DSB数量有关。②放射通过细胞膜信号一靶系统激活, 使细胞发生凋亡。放射线作用于细胞膜使神经酰氨产生增加, 再经神经酰氨诱导细胞凋亡[9]。说明胞膜是射线作用的靶[10]。有研究发现用125I标记DNA产生DNA双链断裂可诱导较高的凋亡发生率, 提示核为作用的靶。但是应用a粒子照射后发生P53增加的实测水平高于计算受照射的胞核所得出的P53增加值[11], 有提示核靶和非核靶均存在。这些对传统的“直接作用和间接作用”, 是在生物机理上的认识进一步加深。对心肌细胞凋亡而言, X射线诱导凋亡作用的靶是膜还是核或二者均是尚待研究。
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