, 随着核科学的进步和核技术的发展, 以及放射性同位素的广泛应用, 放射医学及其相关学科得以迅速发展, 同时电离辐射可能带来的危害也成为不容忽视的问题。特别是近年来放射事故和核恐怖事件的发生, 使得事故后损伤程度的判断及救治极为重要。这就需要了解和确定受辐射照射的剂量, 现有的方法主要有物理、生物和临床的方法[1]。物理剂量计较为准确、可靠, 但是由于佩戴不便等缺点不适用于特殊条件下的佩戴要估算急性突发事故的辐射剂量, 生物学方法是利用生物体标本在电离辐射后留下的辐射特异性损伤, 根据实验中得到的剂量-效应曲线推断辐射剂量的方法。此种方法具有直接性等优势。其中, 染色体畸变分析和淋巴细胞微核技术较为成熟, 但在具体应用中适用剂量范围局限, 不适于对受照群体进行大规模的检测。众所周知, 电离辐射会导致体细胞基因突变, 利用这一原理, 国内外许多的学者利用检测基因突变的方式来研究辐射生物剂量, 其中次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)基因、血型糖蛋白A (GPA)基因位点突变频率的测量较为成熟, 国际上已经广泛应用于放射毒理、遗传毒理和环境医学领域, 而对T细胞受体(TCR)基因突变频率的研究还不成熟, 有待于进一步探索。TCR基因突变分析技术有可能成为一种新的生物剂量计。
1 TCR的生物学特征TCR是外周CD4、CD8淋巴细胞表面的一种蛋白受体, 本身为异质性二聚体, 由α, β或γ, δ双链组成, 其两对等位基因(α, β))和(γ, δ)分别位于14号和7号染色体上。外周血T细胞以α, β亚群为主。TCR基因在个体发育过程中, 由于α链和β链基因的重排和表达发生等位基因排斥现象, 所以每一对等位基因中只有一个能够表达。因此, 尽管TCR基因位于常染色体上, 却类似于女性中X染色体上的基因, 在功能活性上呈单倍性。发生在有活性的TCR基因的单个突变即可导致表现型TCR突变体的产生。TCR的α, β链只有在与另一蛋白质分子CD3结合形成完整的TCRαβ/CD3复合体以后才能被正常转运到细胞膜上。如果TCRαβ的中任何一个发生突变, 所造成的有缺陷的TCRαβ/CD3复合体就会因不能被正常转运到细胞表面而只能累积于细胞质中。
2 TCR突变检测的原理及特点T细胞受体只有和CD3分子结合以后才能发挥正常的生物学作用, 如果TCR的α链和β链基因位点发生突变, 这种复合体就会形成障碍。由于TCRαβ/CD3复合体的完整性决定着TCRα, β基因在细胞表面的表达情况, 因此可以通过检测CD3分子在细胞表面的表达与否间接地研究TCRα, β基因的突变情况。
TCR突变分析技术与其他几种体细胞基因突变分析系统相比有其自身的特点:TCR突变分析技术测得TCR突变频率时所需要的样本血量较少; 试验者可以对突变的T细胞进行体外培养, 以便进一步研究, 因此对试验对象没有特殊限制; 另外, TCR分析技术检测的淋巴细胞无需固定, 所以分析时间大大缩短。
3 TCR突变频率检测的方法用单克隆抗体直接免疫荧光标记流式细胞术检测TCR突变频率。分离外周血淋巴细胞体外染色, 用荧光素异硫氰酸盐(fluorescein isothiocyanate, FITC)标记的CD4抗体呈绿色突光, 由藻红蛋白(phycoerythrin, PE)标记的CD3抗体呈红色突光。正常T淋巴细胞(CD3+、CD)+荧光整体显示桔红色(红加绿)。而TCRocp基因突变细胞(CD、-、CD)+呈绿色荧光。根据荧光信号的强弱来计算TCR突变频率。
4 TCR突变频率作为辐射生物剂置的研究 4.1 TCR突变频率与辐照后时间的关系围绕TCR突变频率与受照后时间的关系, 各国学者进行了众多研究。Vershenya等[2]研究表明, 遭受切尔诺贝利灾难最严重的白俄罗斯南方53个以放射性碘治疗年轻甲状腺癌患者, 经过放射治疗后, TCR突变频率在6个月后增至最大值, 以后呈指数性递减。
Smirnova等人对165名暴露于X射线下16~40a后受照人群进行研究, 根据照射方式和时间分为三组:①急性照射后16~40a。②急性照射后9~13a。③慢性照射后9~13a。分别对三组人群的TCR基因突变频率进行检测, 结果显示TCR基因突变细胞率在三组中均有增加。并且三组突变频率分别为36%, 25%, 15%, 三组的细胞突变频率与对照组比较明显增高。可见, 人体受辐照后40a仍可检测到TCR基因突变。
4.2 TCR突变频率与其他因素的关系TCR突变频率在不同的人群中存在差异, 可能与性别、年龄等因素有关。Zamulae-va等[4]对2001~2004年期间553个受电离辐射污染的俄联邦居民和154个未被照射的对照人群的TCR突变频率进行检测, 将切尔诺贝利核事故中受照人群按年龄和137Cs污染的密度分成三组:①在子宫内, 37~555kBq/m2;②0~14岁, 20~555kBq/m2; ③18或18岁以上137Cs的最高密度(> 555kBq/m2), 结果发现T细胞受体突变频率变化最高的是在子宫内暴露于电离辐射的人群组。
Zamulairva[5]研究体内NO水平与低剂量辐射照射后体细胞基因突变的关系时发现, 64个原子能工厂工人中14%的TCR突变频率超过了对照组95%可信区间, NO水平与TCR突变频率之间呈相关性(R=0.36, P < 0.01)。
另外, 有学者指出机体受照时不同的生理状态可能也影响TCR突变频率。Igari等[6]将C57BL/6N小鼠分为妊娠组和非妊娠组, 用3Gy的γ射线进行照射, 9d后观察脾T淋巴细胞的变异片段, 结果显示:未照射组非妊娠鼠和妊娠鼠之间TCR变异差别无统计学意义, 而照射组妊娠鼠TCR突变频率大约是非妊娠组的两倍, 这可能与血清中孕酮的水平增加有关。由于此方面的报道较少, 有待于进一步研究。
4.3 TCR突变频率与辐射照射后的剂量-效应关系 4.3.1 TCR突变频率与辐照后量效关系在人群中的研究由于核技术的广泛应用, 人们受到电离辐射的危害系数明显增加。原爆、意外照射、放射治疗, 职业性照射、等原因引起的人体损伤越来越受到人们的关注, 国内外学者也针对这部分人群的TCR突变频率与辐照后量效关系进行了大量的研究。不论是何种照射, 引起TCR突变的频率及量效关系均有一定的规律可循。
人体受到电离辐射后数月, 才可以检测到T淋巴细胞的TCR基因突变表型的表达, 因此, TCR基因突变作为生物剂量计常用于受照后较长时间(数月、数年乃至几十年)受照者生物剂量的估算[7]。Taooka等人[8]报道了1949~1989年间Semi-palatinsk核试验基地地区的辐射暴露居住人群的外周血TCR突变频率, 高暴露组人群(Dolom and Sarzhal)TCR突变频率为(5.49±1.78) ×10-4, 低暴露组人群(Kaynarand Semipalatinsk-city) TCR突变频率为(2.88 ±1.14) ×10-4, 而对照组人群(Kokpekti) TCR突变频率为(2.90 ± 1.27) ×10-4, 显然TCR突变频率在髙暴露人群中明显髙于对照组, 随着照射剂量的增加而增加, 对照组和低暴露人群之间的的差别则没有统计学意义。此研究表明TCR突变频率测量在受到照射后40a以后都可以作为一个有用的生物剂量计。
Vershenya等[9]观察了接受不同放射性活度的131Ⅰ药物治疗的53名甲状腺癌患者, 结果表明:实验组TCR突变频率与131Ⅰ给药的放射性活度呈显著的线性的剂量效应关系, 突变频率MF (Mutation Frequency)=1.86 ×10-4+0.30 ×10-4D, P < 0.001, 其中D为给药的131Ⅰ放射性活度。
但是早期, Kyoizumi[10]对广岛203名原爆43~45a后的幸存者(其中78名受照1.5Gy, 125名受照 < 0.005Gy)的研究显示, TCR突变频率与照射剂量(DS86)无明显的量效关系。这可能是由于TCR突变细胞的衰减有关, 有研究表明TCR突变频率的半衰期约为2~3a, 经过40多年的衰减, TCR突变细胞已基本恢复到正常水平。
应对急性和突发辐射事故我们需要一种能够快速检测TCR的方法, Ishioka[11]报道, 外周血淋巴细胞经植物血凝素(PHA)脉冲式刺激后用重组人白细胞介素-2(rhIL-2)短期培养, TCR突变表型在一周内即可检出。刘长安等人[12]参照Ishioka的方法, 选取7名健康男性青年为供血者, 用不同剂量的γ射线照射诱发TCR基因突变, 7d后观察结果显示, TCR突变频率随照射剂量的增加而增高。根据Radj 2(校正的拟合指数), 在0~4Gy范围内拟合出最佳辐射剂量-效应曲线为二次多项式:TCRMF=2.74+6.05D+7.60D2。(F=36237.16, P < 0.01, R2=0.9999)。
4.3.2 TCR突变频率与辐照后量效关系在实验动物中的研究众多学者在利用辐射线照射引起体细胞基因突变的原理对TCR基因突变进行检测时, 观察到TCR基因突变频率与辐射剂量存在着线性关系。Kyoizumi等[13]指出体内自发的TCRMF为10-4, 暴露在遗传毒性物质下时, TCR MF则存在着剂量依赖关系。Fumio Koto等[14]在研究p53基因在小鼠遗传毒性组织损伤细胞凋亡修复方面的作用时发现, 用137Csγ射线进行照射后, 高剂量照射暴露组(1.02mGy/min) p53(+/+)和p53(-/-)基因型小鼠脾T淋巴细胞TCR突变频率符合线性二次方程的剂量-效应模型, (y=a0+a1D+a2D2)。其中在p53(-/-)小鼠中, 系数a0, a1, a2分别为14.1, 8.83和0.551;p53(+/+)小鼠中系数分别为9.79, 2.44和0.571。其中D为辐射剂量。
另有学者[15]将小鼠暴露于0, 1, 2, 3Gy不同剂量的电离辐射下, 6d后用流式细胞仪检测其EL-4淋巴瘤细胞TCR基因表达缺失细胞(CD3-CD4+)的频率。结果显示:最早3Gy射线照射2d后就可以观察到突变细胞, 并且0Gy照射时细胞突变频率为6.7 ×10-4, , 3Gy照射后4~8d时间内细胞突变频率的最大值可达39 ×10-4, 这些数据可以拟合成剂量-效应曲线二次线性方程模型Y=7.1+2.7X+2.6X2。作者同时检测了HPRT基因突变和淋巴细胞微核, 认为TCR突变频率检测的方法与其他方法相比快捷、简便, 是一种实用的致突变的检测手段。
4.4 TCR突变分析技术与其他生物剂量计作为一种新的生物剂量计, 在估算生物计量时的可靠性极为重要。Seyama等[16]报道, 切尔诺贝利(Chernobyl)核电站事故中9名受照者的TCR MF估算剂量与染色体畸变所估算的剂量一致。Saenk等[17]指出在近期照射中, 作为生物剂量计, TCR突变检测比GPA检测更为敏感和有价值。与HPRT基因突变和微核检测相比, TCR检测简便、快捷[8].
5 结束语核能的利用和核技术的广泛使用, 给人类的生产和生活带来极大的便利, 同时使人们面临的电离辐射危害比以往大大增加, 特别是放射工作人员和因事故而受照的人员。为能使这些人员采取有效的防护措施和得到及时的救治, 准确的估算生物剂量起着举足轻重的作用。快速、简便、适用剂量范围宽的理想生物剂量计是放射生物学研究的重要课题。
TCR基因突变频率检测技术是新近发展的生物剂量估算方法, 本身有很多优点, 但此技术的研究还不是很成熟, 不同学者建立的辐射剂量-效应曲线不尽相同, 使得此技术未得到具体的应用。因此, 需要确定其适用剂量范围和辐照类型, 建立准确的TCR突变频率与辐射剂量的量-效关系曲线, 以完善生物剂量估算体系。同时对于受照人群的辐射监测、防护、诊断、救治具有重要意义。随着TCR突变检测技术的进一步成熟, 它的应用前景也会更加广阔。
| [1] |
Dainiak N, Waselcnko JK, Armitage JO, et al. File Hematologist and radiation casualties[J]. Hematology (Am Soc Hema-tol Educ program), 2003, 473-496. |
| [2] |
Vershenya S, Biko J, Drozd V, et al. Dose response for T - cell receptor (TCR) mutants in patients repeatedly treated with 1311 thyroid cancer[J]. Mutant Res, 2004, 548(1-2): 27-33. DOI:10.1016/j.mrfmmm.2003.12.015 |
| [3] |
Smirnova SG, Orlava NV, Zamulaeva IA, et al. Mutation at the T - cell receptor locus in people a long time after acute and prolonged irradiation[J]. Radiats Biol Radioecol, 2002, 42(6): 624-627. |
| [4] |
Zamulaeva IA, Smirnova SG, Orlova NV, et al. Somatic mutagenesis at T - cell receptor locus in inhabitants of radiation polluted regions as a result of the Chernobyl disaster[J]. Radiats Biol Radioecol, 2006, 46(3): 307-314. |
| [5] |
Zamulaieva IA, Orlova NV, Smirnova SG, et al. The correlation between intracellul - arlevel of nitric oxide and frequency of gene somatic mutations after low dose radiation exposure[J]. Radiats Biol Radioecol, 2007, 47(1): 86-92. |
| [6] |
Igari Y, Igari K.Kunugita N, et al. Prolonged increase in T - cell receptor(TCR) variant fractions of spleen T lymphocytes in pregnant mice after gamma irradiation[J]. Radiats Res, 2007, 168(1): 81-86. DOI:10.1667/RR0288.1 |
| [7] |
Iwamoto KS, Hirai Y, Umeki S, et al. A pjositive correlation between T - cell receptor mutant frequency and dicentric chromosome frequencies in lymphocytes from radiotherapy patients[JJ[J]. Radiat Res, 1994, 35: 92-103. DOI:10.1269/jrr.35.92 |
| [8] |
Taooka Y, Takeichi N, Noso Y, et al. Increased T -cell receptor mutation frequency in radiation - exposed residents living near the Semipalatinsk nuclear test site[J]. Radiat Res (Tokyo), 2006, 47(Suppl A): A179-181. |
| [9] |
Vershenya S, Biko J, Drozd V, et al. Dose response for T - cell receptor (TCR) mutants in patients repeatedly treated with 1311 for thyroid cancr[J]. Mutat Res, 2004, 548(1-2): 27-33. DOI:10.1016/j.mrfmmm.2003.12.015 |
| [10] |
Kyoizumi S, Umeki S, hirai Y, et al. Frequency of mutant T Itmphocytes defective in the expression of the T - cell antigen receptor gene among radiation - exposed people[J]. Mutat Res, 1992, 265(2): 173-180. DOI:10.1016/0027-5107(92)90046-5 |
| [11] |
Ishika N, Umeki S, Hirai Y, et al. Stimulated rapid expression in vitro for early detection in vivo T - cell receptor mutations induced by radiation exposure[J]. Mutant Res, 1997, 390: 269-282. |
| [12] |
刘长安. 7射线诱发培养淋巴细胞TCR基因突变的剂量-效应关系[J]. 中国工业医学杂志, 2005, 18(1): 23-25. DOI:10.3969/j.issn.1002-221X.2005.01.008 |
| [13] |
Kyoizumi S, Kusunoki Y, Hayashi T. Flow cytometric measurement of mutant T cells with altered expression of TCR: detecting somatic mutations in humans and mice[J]. Methods Mol Biol, 2005, 291: 197-204. |
| [14] |
Fumio Kato, Hioto Kakihara, Naoki Kunugita, et al. Role of tometry after X - irradiation on EL - 4 mice lymphoma cells[J]. Toxicol Sci, 2007, 32(4): 377-386. DOI:10.2131/jts.32.377 |
| [15] |
Seyama T, Akiyama M, Kusunoki Y, et al. Analysis of somatic mutation frequency among persons exposed radiation from the Chemoby nuclear power plant accident[J]. RadiatRes, 1993, 34: 35. |
| [16] |
Saenko AS, Zamulaeva IA. Results of and prospects for methods of determination of the frequency of mutant cell for p53 gene apoptotic repair of genotoxic tissue damage in mice[J]. Tadiat Res Suppl, 2002, 43: S209-S212. |
| [17] |
Kunugita N, Mei N, Goncharova T, et al. Measurement of mutant frequency in T - cell receptor(TCR) gene by flow cy- glycophorin A ane T - cell receptor loci to estimate longterm genotoxic effect of ionizing radiation[J]. Radiats Biol Radioecol, 2000, 40(5): 549-553. |