美罗华是一种人鼠嵌合的CD20抗体, 是美国食品药品管理局第一个批准用于耙向治疗非霍奇金淋巴瘤(NHL)的单克隆抗体, 尽管其确切的作用机制尚不明确, 但临床上与常规的化疗方案联合应用, 明显提高了CD20阳性的B细胞淋巴瘤的治疗反应率。然而, 仍有部分病人对美罗华初始治疗反应欠佳, 或逐渐出现美罗华耐药^{[1, 2]}。由于NHL是一种对射线敏感的肿瘤, 复发及对化疗药物耐药的NHL对射线依然敏感。为了寻求更加有效的治疗恶性淋巴瘤的策略, 将现有的各种治疗方法有机结合起来, 我们设想能否将美罗华联合放射用于淋巴瘤的治疗。本研究以耐辐射的人Burkitt淋巴瘤细胞系为研究对象, 观察美罗华对其辐射诱导的细胞死亡的影响, 并探讨ROS的作用。

1 材料和方法 1.1 材料

CD20单抗(美罗华)购自上海罗氏公司, Raji细胞株为人Burkitt淋巴瘤细胞系, 购自中国科学院上海细胞库, RP-MI1640培养基(Gibco公司), 小牛血清(杭州四季青), PI染料(Sigma公司), Triton-100(德国E.Merck产品), 吖啶橙(AO, Edward Gurr产品), 溴乙锭(EB, Sigma公司), 丽丝胺罗丹明B(SRBSigma公司), N-乙酰半胱氨酸(NAC, Beyotime)。荧光探针2', 7'-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)试剂盒(Beyotime), 突光显微镜(Olympaus, 日本),; 激光共聚焦显微镜:TCS2SP2型(Leica Co, Germany)。

1.2 方法 1.2.1 样本辐射

X射线为美国Varian公司生产的CI2100C型电子直线加速器产生, 能量8MeV, 源靶距100cm, 剂量率1.6 Gy/min。美罗华终浓度为20mg/L, 照射剂量为0~10Gy。

1.2.2 SRB法测定细胞活性

不同处理后细胞, 按预先设置的细胞浓度接种于48孔板, 每个处理重复五孔, 不加细胞的1640培养液为空白孔, 不加美罗华孔为对照孔。继续培养7d后, 每孔加入50μl冰80%三氯醋酸(终浓度10%), 置4℃, 1 h后自来水冲洗五次, 空气干燥后100μl SRB溶液染色, 醋酸洗涤后Tris缓冲液溶解, 酶联免疫检测仪515nm波长处测定OD值。细胞存活率(%)=处理组的平均OD值/对照组的平均OD值×100%。

1.2.3 细胞内活性氧(ROS)测定

利用荧光探针2', 7'-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)试剂盒检测ROS。DCFH-DA本没有荧光, 可以自由穿过细胞膜, 进人细胞内后, 可以被细胞内的酯酶水解生成DCFH, 细胞内的ROS可以氧化无荧胞内H₂O₂, 目前认为对其他过氧化物也同样敏感。不同处理后的细胞, 分别于培养后2h、4h、8h、12h、20h和24h, 测定细胞内ROS动态变化。处理后细胞PBS洗涤2次, 加人2', 7'-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)(终浓度1μM)于含有细胞的培养基中, 37℃孵育30min, 培养液洗涤两次, 激光共聚焦显微镜测定ROS含量。激发波长为485mn, 发射波长535nm, 在40倍镜下, 利用含有图像处理系统和自动摄像的装置选取不同视野拍摄图像, 扫描图像存入计算机硬盘以便分析备用, 利用Leica自带的分析软件分析荧光强度, 每个剂量点选取三个不同的视野进行分析, 将荧光强度值汇总取平均值, 各处理组的ROS量以下列公式计算:〔ROS〕=各处理组的平均测定数值/未处理的对照组的平均测定数值。

1.2.4 细胞凋亡分析

采用AO/EB双重染色测定凋亡细胞。不同处理后的样品, 吸出50μl细胞悬液于载玻片上, 加人2μl混合荧光染料(100mg/L AO和100mg/L EB各1μl), 压上盖玻片, 荧光显微镜观察细胞形态。于20min内计数300~500个细胞。活细胞显示均匀的绿色, 早期凋亡细胞凝聚的染色质呈黄绿色的斑点, 晚期凋亡细胞显示块状橘红色细胞核, 坏死细胞呈现均匀的橘红色。

统计学分析X射线照射后细胞存活曲线用线性平方模型拟合, SF=exp(-αD-βD²)。ID50, 引起50%细胞生长抑制所需的照射剂量, 辐射敏感性用DEF(dose enhancement factor)表示:ID50(-美罗华)/ID50(+美罗华)。两组比较采用Student's t检验, 所有实验至少重复两次。

2 结果 2.1 美罗华、低剂量H₂O₂预处理增加Raji细胞对X射线的辐射敏感性

用对数生长期的Raji细胞分别与美罗华(终浓度20mg/L)、20μM、40μM的H₂O₂孵育2朴.然后给予0~10 Gy X射线照射, 继续培养5~7d, SRB法测定细胞存活。从图 1可以看出, 显示联合美罗华后.Raji细胞对X射线诱导的细胞死亡分数明显提高。Raji项胞本身较耐辐射, 单照射组, 存活曲线可看到明显的肩部, 加入美罗华后肩部逐渐下移。美罗华+照射组和照射组的ID50分别为2.80 Gy和5.08 Gy, 美罗华的DEF为1.81。20μM、40μM的低剂量H₂O₂对Raji细胞无明显细胞毒性, 但可以提高细胞的辐射敏感性, 并呈现浓度依赖性。H₂O₂(20μM)+照射组、H₂O₂(4μM)+照射组和照射组的ID50分别为3.63 Gy、2.64 Gy和5.08Gy; H₂O₂(20μM)和H₂O₂(20μM)的DEF分别为1.40和1.92。

2.2 美罗华增加X射线诱导Raji细胞内ROS产生

利用2', 7'-二氯二氢荧光素双醋酸盐(DCFH-DA)检测细胞内ROS, 美罗华(终浓度20mg/L)与Raji细胞共同孵育24h后, 给予X射线辐照(6 Gy), 动态观察Raji细胞美罗华组、美罗华+照射组和单照射组处理后不同时间细胞内ROS变化, 图 2显示三个处理组在处理后2h细胞内活性氧明显升髙, 美罗华联合照射组ROS产生明显高于单照射组。随时间延长, 活性氧逐渐减少, 至处理后20h, 与对照相比较, 细胞内活性氧基本消失。单加美罗华组, 于培养后2h亦可检测到增加的细胞内ROS, 持续8h, 10h后逐渐消失。

2.3 美罗华增加X射线诱导的Raji细胞凋亡与ROS生成相关

美罗华(终浓度20mg/L)与Raji细胞共同孵育24h后, 给予X射线辐照(6Gy), 或与抗氧化剂NAC(10mM)孵育1h后, 再给予X射线辐照(6Gy), 然后用1 640培养液洗去药物, 加人完全培养液继续培养24h, AO/EB双重染色, 荧光显微镜下计数凋亡细胞。美罗华组未见明显细胞凋亡; 与单照射组相比较, 美罗华+照射组在处理后24h, 出现明显的细胞凋亡。NAC可明显抑制美罗华+照射组和单照射组的细胞凋亡(图 3a, 3b)。

2.4 美罗华增加Raji

细胞对H₂O₂的氧胁迫敏感性Raji细胞与美罗华共培养24h后, 加人不同浓度H₂O₂, 常规培养48h, SRB法测定细胞存活, AO/EB双重染色, 荧光显微镜下计数凋亡细胞。图 4显示, 美罗华可增加不同浓度H₂O₂所致的细胞生长抑制, 诱导凋亡细胞增加。

3 讨论

Berinstein等^[3]发现美罗华治疗后三个月, 病人血清中美罗华浓度仍保持在20.3mg/L, 因此, 本实验选择美罗华终浓度为20mg/L。有关美罗华对肿瘤细胞辅射敏感性的影响报道较少, 而且结论也不一致。Skvortsova等^{[4, 5]}报道美罗华通过凋亡和细胞周期蛋白调控(e.g.c-myc, bcl-2, CDKIsp21/WAFl and P27/KIP1, P53), 可增加体外耐辐射的淋巴瘤细胞的辐射敏感性。最近Kapadia等^[6]报道美罗华在不同的照射剂量时, 可能产生辐射增敏和辐射保护两种截然不同的作用。经典的克隆存活测定是测定辐照后细胞存活分数的标准方法, 但由于其费时费力(通常需14d以上观察细胞克隆数), 而且对于一些克隆形成能力差的细胞, 这种方法的准确性就显得不理想。有学者对中度耐辐射的肿瘤细胞, 采用SRB法检测辐射后细胞增殖变化, 发现辐射后培养足够长的时间(一般为六个细胞倍增时间), SRB所测的的细胞存活分数与传统的克隆存活法测定的结果有很好的可比性^{[7, 8]}。Raji细胞对辐射较为耐受, 不能在软琼脂上生长。为了研究美罗华对X射线所致Raji细胞的生长抑制作用, 笔者采用延长培养时间(5~7d)的SRB法测定X射线照射后细胞存活分数, 而且, 为了克服在较高剂量照射时, 细胞浓度太低影响SRB的染色结果, 以及在较低剂量时, 细胞培养时间较长所致细胞过密等, 我们将照射后的细胞接种于48孔板代替常规的96孔板。本研究发现, 无论较低剂量(2Gy), 还是较高剂量(10Gy)X射线照射, 20mg/L美罗华均可增加Raji细胞对X射线的辐射敏感性, 与Skvortsova等^{[4, 5]}的结果一致。

体外实验发现, 单独应用美罗华可诱导某些肿瘤细胞凋亡。我们发现不同浓度美罗华(0.1~100mg/L)对体外培养的Raji细胞产生轻微的生长抑制作用, 未见诱导明显的凋亡(数据未显示)。美罗华联合6Gy X射线照射后可明显增加辐射所致的细胞凋亡, 而且, 照射前给予NAC预处理, 可以减少这种凋亡的发生, 以上提示, 美罗华增加辐射所致的细胞凋亡可能部分与美罗华增加辐射后细胞内ROS产生有关。

Raji细胞与美罗华共同孵育后30min, 就可检测到ROS产生, 持续6h以上, 8h后逐渐消失。另外, 不同浓度美罗华(0.1~100mg/L)对Raji细胞无明显生长抑制和凋亡诱导作用(数据未显示), 提示该ROS对细胞无明显毒性作用。本研究发现美罗华联合照射组ROS明显高于单照射组。当细胞受粒子辐射作用时, 在短时间内吸收辐射的能量, 产生多种自由基, 这些过量自由基可攻击DNA分子中的碱基、核糖和磷酸二酯键, 引发脂类过氧化作用, 改变生物膜的通透性, 影响膜中物质转运、能量转化和信息识别。目前相当多的证据已经证明ROS为重要的细胞内和细胞外信使, 促进酪氨酸激酶磷酸化, 抑制某些酪氨酸磷酸酶活性, 激活Src和Syk家族激酶^[9]。目前尽管CD20确切的分子机制还不清楚, 但是较多文献报道, 当CD20抗原与CD20抗体作用后, CD20在脂膜中发生迁移, 引起Src家族成员(如, Lyn, Fyn和Lck等)及其相应的配体聚集细胞浆, 诱导Ca的跨膜转运^[10-12]。CD20抗体美罗华增加X射线照射引发的细胞凋亡, 除外增加辐射产生的ROS, 引起细胞DNA和生物膜损伤这一因素, 我们推测, 美罗华作用后, ROS作为可能作为一种细胞内信号分子, 诱导Src家族激酶PTK活化, 使得PLCg2酪氨酸激酶磷酸化, 动员细胞内钙离子释放和CasPase 3活化, 诱导细胞凋亡。为了了解ROS在美罗华辐射增敏中的作用, 一方面, 我们发现, 与对细胞无明显毒性的低浓度H₂O₂预培养24h的Raji细胞, 其辐射敏感性明显提高; 另一方面, 我们联合美罗华和H₂O₂作用于Raji细胞, 发现美罗华同样可以增加H₂O₂诱导的细胞凋亡作用, 增加对H₂O₂所致的细胞损伤的敏感性。由上我们推测, 美罗华预处理的Raji细胞产生一定水平的ROS, 尽管对细胞本身没有明显的毒性, 但是可能更利于发挥辐射诱导的细胞杀伤作用。