核事故病人、长期接触射线或肿瘤病人接受放疗时常伴随严重的免疫功能低下已成为临床常见的棘手问题。淋巴细胞是对辐射最敏感的细胞族群之一, 是放射损伤早期诊断和受照剂量估算的重要参考指标。随着辐射免疫学的飞速发展, 电离辐射对免疫系统, 尤其是对淋巴系统的影响越来越受到重视。笔者通过对急性辐射损伤对小鼠T细胞功能亚群CD3, CD4和CD8的影响的观察, 并对Th1和Th2代表性细胞因子γ干扰素(IFN-γ)和白细胞介素4(IL-4)进行检测, 为深入探索辐射损伤的分子免疫学机制提供依据。
1 材料与方法 1.1 实验动物C57BL/6j小鼠50只, 6~8周龄, 体重(20.5 ±1.23) g, 购于北京大学医学部实验动物中心。采用盒养方式在二级动物房实验动物无菌饲养箱中饲养。实验动物自由饮食饮水。于照射后24h脱颈处死动物。
1.2 动物模型制作及分组大鼠均在北京师范大学低能核物理研究所, 北京辐射中心进行60Co源照射。照射剂量率为0.7 Gy/min。小鼠按受照剂量随机分为5组:正常对照组、0.7Gy组、1.4Gy组、2.8Gy组和5.6Gy组每组10只小鼠。于照射后24h脱颈处死各组动物, 取脾脏制作单淋巴细胞悬液。
1.3 T淋巴细胞功能亚群标本制备和检测方法在冰上制取单细胞悬液, 调整细胞悬液细胞数为107/L。加入单克隆CD3, CD4, CD8荧光抗体50μl进行细胞荧光染色40min, 加入红细胞溶解液1.5ml, 5min充分溶解红细胞后1 500r/min, 5min离心, 去除离心上清液, 加入荧光细胞洗涤液1.5ml, 振荡悬浮细胞。1 500r/min, 5min离心, 去除上清液, 加入细胞保存液1ml, 振荡悬浮细胞。用美国BECTOM/DICKINSON FACScan流式细胞仪进行检测。
1.4 细胞因子IFN-γ和IL-4标本制作及检测:制备单细胞悬液调整悬液细胞数为2 ×106/L。加入ConA 5ug/ml, 并按比例加入Monensin, 37℃、5% CO2孵箱培养8h, 取脾细胞悬液用荧光抗体对细胞表面抗原进行标记, 室温暗处孵育30min, 加入溶血素2ml, 室温暗处10min, 1 000r/min离心5min, 用含5%血清PBS洗1次, 加入固定液0.5ml固定20min, 1 000r/min离心5min, 加入2ml Permeabilization Washbuffer穿透液细胞打孔2次, 1 000r/min离心5min, 加入细胞内染色荧光IFN-γ抗体6μl和IL-4抗体6μl, 室温暗处孵育30min, 2ml穿透液洗涤2次。用美国BECTOM/DICKINSONFACScan流式细胞仪进行检测。
1.5 统计学处理全部实验数据采用平均数±标准差(x±s)表示。采用t检验进行统计学处理。
2 结果 2.1 不同剂量辐射损伤对小鼠淋巴细胞功能亚群CD3+, CD4 +, CD8+和CD4+/CD8+比值的影响见表 1。表 1显示, 各照射剂量组小鼠脾T-淋巴细胞功能亚群CD3+, CD4+和CD8+均有明显降低, 各剂量组降低幅度与受照剂量明显相关。其中CD8+对辐射损伤的敏感性明显大于CD4+。各受照剂量组分别与空白对照组比较, 差异均有统计学意义(P<0.01)。CD4+/CD8+比值显示照射后均有明显升高, 与空白对照组比较均升高100%以上(P<0.01)。上述结果提示电离辐射对T-淋巴细胞功能亚群CD3, CD4和CD8有明显的损伤作用。
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表 1 不同剂量辐射损伤后小鼠淋巴细胞功能亚群变化比较(%, x±s) |
见表 2。表 2显示照射后各剂量组Th1和Th2均较空白对照组明显降低, 其中Th1降低明显高于Th2, 并与受照剂量高低有明显的线性关系。Th2在照射剂量大于1.4Gy组发生明显降低(P<0.01)。Th2/Th1比值分析表明受照剂量大于2.8Gy组Th2/Th1比值较空白对照组明显升高(P<0.01)。上述结果提示低剂量辐射对Th1有明显影响, 其影响因数大小与照射剂量大小有关。照射剂量大1.4Gy, Th2可发生改变, 在受照剂量大于2.8Gy, Th2/Th1比值宜发生明显改变。
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表 2 不同剂量辐射损伤后小鼠脾淋巴细胞细胞因子改变分析(%, x±s) |
T淋巴细胞功能亚群CD3, CD4和CD8在急性辐射损伤后的改变很早就引起人们的重视。Anderson[1]最早报道了电离辐射能引起免疫系统和淋巴细胞的严重损伤, 以后Harrington等[2]研究了γ射线1~7 Gy照射对小鼠脾单个细胞群的损伤效应, 发现电离辐射能引起T、B细胞迅速减少, 对丝裂原的反应能力明显降低。而Savina等[3]研究发现辐射能引起胸腺免疫功能长期低下和免疫细胞因子分泌功能失调。本研究着重观察了不同剂量γ射线照射对小鼠脾淋巴细胞功能亚群CD3, CD4和CD8的影响, 特别是通过对Th1和Th2代表性细胞因子IFN-γ和IL-4的测定, 观察T-淋巴细胞功能亚群变化的特点, 以获得辐射损伤对细胞和体液免疫影响的认识。
辐射引发机体细胞和体液免疫功能低下的重要原因之一是受照后T-细胞功能亚群数量和功能的变化。文献报道照射剂量在6~12 Gy范围内CD4和CD8改变与受照剂量呈明显的量效关系[4]。本实验观察结果发现受照剂量在0.7Gy时, 脾淋巴细胞CD3+, CD4+和CD8+即可发生明显降低, 随着照射剂量的增加, 其降低幅度逐渐加大。同时发现CD8+降低幅度较CD4+降低更为明显。CD4+/CD8+比值显示照射后各剂量组CD4+/CD8+比值均有明显升高, 与空白对照组比较均升高100%以上(P<0.01)。上述结果与同类研究结果相一致。
T-淋巴细胞功能亚群数量和功能变化与淋巴细胞凋亡, 细胞核DNA断裂、蛋白变性和染色体畸变有关。目前T淋巴细胞CD4和CD8在急性辐射损伤后改变的研究集中在不同亚群的辐射敏感性上[5]。由于外周T淋巴细胞是不均一群体, 按T淋巴细胞受体(TCR)的类型可分为不同的辅助T细胞(helperTcell, Th)。辅助T细胞对于机体的特异性免疫和非特异性免疫, 以及对细胞和体液免疫均有重要的调节作用。文献提出, 小鼠T淋巴细胞CD4按细胞因子产生的模式和生物学功能, 可分为两种极不相同的亚群, 分别称为Th1和Th2。Th1主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等Ⅰ类细胞因子, 通过促进CTL、NK细胞及巨噬细胞活化和增殖, 介导细胞毒效应。Th2主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等Ⅱ类细胞因子, 其主要功能在于刺激B细胞增殖, 并产生抗体, 参与体液免疫。由于Th1和Th2细胞分别调控细胞和体液免疫, 一旦Th1和Th2细胞之间的平衡被打破, 必然会使某一种免疫占据优势, 另一种免疫处于劣势, 从而诱发机体免疫功能改变[6]。
本研究通过对不同辐射剂量损伤小鼠脾细胞Th1和Th2的代表性细胞因子IFN-γ和IL-4活性检测, 观察不同剂量辐射损伤后Th1和Th2功能变化, 以探讨电离辐射损伤对细胞和体液免疫的影响。研究结果显示:照射后各剂量组Th1均较空白对照组明显降低, 其改变幅度与受照剂量有明显的线性关系, Th2在照射剂量大于1.4Gy组发生明显降低。Th2/Th1比值在受照剂量大于2.8Gy组与空白对照组比较发生明显升高。提示小剂量辐射对Th1即有明显影响。在受照剂量大于2.8 Gy, Th2/Th1比值易发生明显改变。
IFN-γ和IL-4是调节细胞和体液免疫功能的关键细胞因子, 二者之间相互作用共同调节机体的免疫平衡[7]。因此研究Th1型和Th2型细胞的功能及变化对于评价机体的免疫功能状态及免疫细胞的增殖分化程度具有重要作用。本研究观察和比较两种T细胞功能亚群在急性辐射免疫损伤中的变化结果表明, 不同剂量电离辐射后脾淋巴细胞分泌IFN-γ的功能均有显著降低, 而脾淋巴细胞分泌IL-4各剂量组未见显著差异。由于辐射损伤后IFN-γ活性明显降低, 鼓IFN-γ/IL -4分析显示其比例失衡。Han等[8]研究发现, γ射线照射能明显抑制IFN-γ的表达和其介导的Th1型免疫反应。由于IFN-γ主要通过促进Th1分化和抑制Th2分化使Th1细胞处于优势, 因而推测, 照射后上述两类细胞因子之间的平衡失调, 这可能是导致急性放射损伤免疫调节失调和免疫功能障碍的关键因素。Th1/Th2比率失衡在辐射诱发免疫性疾病的发病机制中具有较重要作用。鼓检测Th1或Th2细胞因子不仅可作为辐射诱发免疫性疾病的辅助诊断, 而且有利于分析疾病发生发展的规律和指导临床治疗。因此检测Th1/Th2调节免疫细胞功能亚群的变化, 特别是在调控细胞和体液免疫方面起着至关重要作用的[9]。
淋巴细胞是一群具有执行细胞免疫功能及免疫调节功能的特殊标志细胞, 放射损伤早期诊断和受照剂量估算常常以淋巴细胞作为重要参考指标, 故电离辐射损伤对免疫系统的影响, 尤其是辅助T细胞(Th1和Th2)的失衡在辐射诱发的免疫改变的影响越来越受到重视。因此, 从调节免疫细胞功能亚群, 特别是在调控细胞和体液免疫方面探索辐射诱发机体免疫功能变化及发病机制, 为辐射免疫研究提供了新的思路和切入点。
| [1] |
Anderson RE. Ionizing radiation and the immune response[J]. Adv Im-munol, 1976, 24: 215-235. DOI:10.1016/S0065-2776(08)60331-4 |
| [2] |
Harrington NP, Chambers KA, Rose WM, et al. Radiation damage andimmune suppression in splenic mononuclear cell populations[J]. Clin Exp Immunol, 1997, 107: 417-424. DOI:10.1111/cei.1997.107.issue-2 |
| [3] |
Savina NP. Disordered thymus function and endocrine control as one of thebases for the development of a late postradiation immunodeficiency[J]. Radiat Biol Radioecol, 1995, 35(4): 463-480. |
| [4] |
崔玉芳, 丁彦青, 徐菡, 等. 大剂量γ线照射对小鼠免疫功能近期、远期的影响[J]. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(6): 675-677. DOI:10.3321/j.issn:1007-8738.2004.06.009 |
| [5] |
田海林, 童林, 秦立强, 等. γ-辐射对小鼠淋巴细胞亚群昼夜节律的毒效应[J]. 工业卫生与职业病, 1999, 25(6): 352-355. |
| [6] |
何广胜, 周玲, 吴德沛. Th1和Th2细胞的分化调节机制[J]. 中华血液学杂志, 2005, 26(2): 125-128. DOI:10.3760/j:issn:0253-2727.2005.02.021 |
| [7] |
Park HR, Jo SK, Paik SC. Factors effecting the Th2 likeimmune response after gamma irradiated:low production of IL-12 heterodimer in antigen presenting cells and small expression of the IL-12 receptor in T cells[J]. Int J Radiat Biol, 2005, 81: 221-231. DOI:10.1080/09553000500077088 |
| [8] |
Han SK, Song JY, Yun YS, et al. Gamma irradiation reduced IFN-gamma expression, STAT1 signals, and cell2mediated immunity[J]. J Biochem Mol Biol, 2002, 35: 583-589. |
| [9] |
靳巍, 崔玉芳, 安晓霞, 等. γ射线对小鼠Th1和Th2细胞功能亚群的影响[J]. 中华放射医学与防护杂志, 2007, 27(2): 124-128. DOI:10.3760/cma.j.issn.0254-5098.2007.02.005 |