苞叶雪莲(S. obval-lata DC. Edgew)是菊科植物凤毛菊属(Saussurea DC)、雪莲亚属植物, 为生长在海拔3 700~4 800 m高山草甸、稀疏灌木丛地的多年生草本。其生存环境具有低温、风大、氧气稀薄、紫外辐射强等特点, 多产于青海、新疆、西藏、四川西部、云南西北部^[1]。苞叶雪莲药性苦寒, 具有消炎镇痛、清热解毒、舒经活络等作用。还有研究表明^{[2, 3]}, 其提取物中的活性成分能促进细胞超氧化物歧化酶活性, 对抗氧自由基的损害。笔者通过辐射损伤小鼠来初步探讨苞叶雪莲水提物的辐射防护作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物

昆明种小鼠50只, 雄性、6~8周龄、体重(20±2)g, 由昆明医学院动物实验部提供。

1.2 实验药物

苞叶雪莲(产地西藏)由云南省中医中药研究所提供, 在云南大学天然药物教研室制成含生药浓度为0.3 g/ml的水提液, 4℃冰箱保存待用。

1.3 主要实验试剂与仪器

RPMI-1640(GIBCO公司生产, 批号:1296119)、高氯酸、苦味酸、氯化钙、冰醋酸、福尔马林、西门子直线加速器、离心机、普通光学显微镜、血细胞计数仪、分光光度计、电子天平、烘箱等。

1.4 实验方法 1.4.1 实验动物分组

将50只小鼠按体重分层随机抽样分成5组, 即:正常对照组(control组)、单纯照射组(IR组)、照射+高剂量给药组(IR+HD组)、照射+中剂量给药组(IR+MD组)、照射+低剂量给药组(IR+LD组), 每组10只。

1.4.2 给药剂量及方式

按小鼠体重将实验药物分别给予IR +HD组3g/(kg.d)(用生理盐水稀释为0.2ml, 灌胃给药, 下同)、IR+MD组1.5g/(kg.d)、IR+LD组0.75g/(kg.d), Control组和IR组分别灌0.2ml的生理盐水, 均连续灌胃5d;第6d予各照射组照射后, 再连续灌胃5d(方法同前), 随后观察至第18天。

1.4.3 辐射条件及剂量

云南省肿瘤医院放疗中心, 直线加速器6MV-X射线给予各照射组小鼠一次全身照射, 照射剂量:6Gy, 剂量率:10cGy/s。

1.5 观察指标

实验第18天, 将所有小鼠称重后股静脉取血, 并颈椎脱臼处死小鼠, 取股骨骨髓及脾脏, 测定体重、静血中的RBC、WBC、PLT、Hb、骨髓有核细胞数、骨髓DNA含量(A值)(按公式DNA=40×50×A计算DNA量)、脾重量、脾指数(脾指数=脾脏重量/小鼠体重)。

1.6 统计学处理

采用统计软件SPSS11.5对数据进行方差分析, 检验水准α=0.05。

2 结果

如表 1、表 2、表 3所示, 与control组比较, IR组的体重、静脉血中RBC、WBC、PLT、Hb含量、骨髓DNA含量(A值)、骨髓有核细胞数、脾重量、脾指数均明显下降, 存在统计学差异, P＜0.01(其中脾重量、脾指数P＜0.05)。

与IR组比较, 各给药+照射组的体重、WBC、PLT、骨髓DNA含量(A值)、骨髓有核细胞数、脾重量、脾指数均明显升高, 存在统计学差异, P＜0.01(其中血小板的IR+LD组、脾重量、脾指数P＜0.05), 各组均以IR+HD组升高最为明显; 各给药+照射组RB C、Hb含量与IR组比较无统计学差异, P＞0.05。

3 讨论

电离辐射对组织细胞的损伤很大程度上依赖水辐射产生的大量自由基介导。自由基包括超氧阴离子自由基(O₂^-)和羟自由基(^·OH)及有机自由基(R^·, RO^·, ROO^·)等, 它们有很强的生物活性。适量自由基对细胞的分裂、生长起积极作用, 但过剩则会损伤细胞膜, 使DNA断裂、蛋白质变性、酶失活, 造成细胞功能丧失、周期紊乱和遗传的不稳定性, 甚至直接引起细胞解体和死亡。还有一些含氧产物如单线态氧、过氧化氢(H₂0₂)等, 它们虽不属自由基, 但含有活性氧, 其化学性质较基态氧活泼, 可在自由基反应中产生, 同时还可直接或间接触发自由基反应。它们和自由基一样, 当产生过剩时会损伤机体。

3.1 对细胞的损伤 3.1.1 对DNA的损伤

DNA是生命信息的载体, 是细胞中最重要的生物大分子。自由基对DNA的损伤包括碱基、核糖、磷酸基损伤, 最严重者为直接引起DNA断裂。

3.1.2 对生物膜的损伤

生物膜的损伤主要是通过氧自由基的脂质过氧化作用造成, 其损伤途径为:氧自由基+细胞膜脂质→脂质过氧化反应→过氧化脂质→丙二醛+细胞成分→脂褐质。在有氧条件下, 辐射产生的氧自由基和活性氧可通过脂质过氧化作用造成生物膜中饱和与不饱和脂肪酸的比例失衡, 改变膜结构的刚柔特性, 增加膜的通透性, 甚至发生崩解。

3.1.3 对蛋白质的损伤

自由基可以通过脂质过氧化产物醛类物质造成蛋白质中巯基和氨基的氧化损伤, 此种应看作自由基间接作用的结果。同时自由基也可直接造成蛋白质的损伤, 表现在一级结构上肽链断裂、氨基酸组成改变, 另外还有空间构象上的改变;

3.1.4 致死效应

自由基致DNA、蛋白质(酶)的损伤固定, 干扰了DNA复制、转录和修复是细胞死亡主要原因。另外自由基还有致突、致癌等远期效应。

3.2 药物对辐射损伤的防护作用

主要是通过清除辐射产生的大量自由基来防止或减轻其对重要生物大分子(如DNA、蛋白质)和细胞膜的攻击。

3.2.1 由基的清除或钝化

辐射防护药物通过其化合物上的氢转移中和自由基。研究表明, 自由基损伤中以氢氧自由基(^·OH)的危害最大, 所以辐射防护药物的作用与^·OH清除能力成正比。

3.2.2 氧化应激的防御

大量自由基使机体内氧化和抗氧化的平衡失衡而使氧化作用占优势, 即氧化应激。辐射防护药物可刺激机体产生多种酶, 如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(GSH)、过氧化氢酶等, 来对体内的氧化应激进行“脱毒”, 从而得到保护作用。

3.2.3 远期效应的防止或减轻

通过药物对辐射引起的癌基因和抑癌基因进行调控, 使受损DNA得到修复, 通过诱导细胞的凋亡, 在一定程度上减少DNA突变和细胞癌变的发生。

苞叶雪莲作为常用的中药材, 急、慢性毒理试验证明, 其药用安全可靠, 无任何副作用^[4]。现代药理研究进一步发现^{[5, 6]}, 苞叶雪莲提取物中含有丰富的黄酮类、三萜类物质以及生物碱、内酯甾醇、多糖等多种成分, 其主要次生代谢物包括黄酮、粗毛豚草素、山柰素、金合欢素、槲皮素、皂甙、芦丁等多种活性物质。这些活性物质中大部分具有清除自由基和抗氧化作用^[7]。其中黄酮能提高超氧化物歧化酶(SOD)活性, 降低细胞脂质过氧化物的生成, 对羟自由基所致的多种细胞损伤都有不同程度的保护作用^[8]; 槲皮素有清除^·O2、^·OH和单线态氧等活性氧的能力, 能有效保护生物膜免受自由基的损害^[9]; 皂甙能抑制钙通道, 显著抑制黄嘌呤——次黄嘌呤氧化酶所致的自由基增多, 还能明显抑制生物膜的脂质过氧化, 并提高SOD和谷胱苷肽过氧化物酶活性^[10]; 多糖、粗毛豚草素和金合欢素均具有清除自由基和抗氧化的能力^[11]。此外, 研究表明^[12], 苞叶雪莲还含有丰富的K、Zn、Cu元素, 其中尤以Zn、Cu远高于一般植物性食物。Zn、Cu是酶蛋白空间构成的重要微量元素, 对机体内DNA、蛋白质损伤的修复具有重要作用。K参与细胞静息电位的维持, 对生物膜脂质过氧化损害具有稳定作用。

本实验以辐射高度敏感的造血系统(骨髓)和免疫系统(脾脏)作为主要研究对象, 观察苞叶雪莲水提物对辐射损伤小鼠的防护作用。结果显示各给药组小鼠的体重、外周血象中的白细胞和血小板、骨髓DNA含量(A值)、骨髓有核细胞数、脾重量、脾指数等均明显高于单纯照射组, 其中以高剂量给药组升高最为明显, 并存在显著性统计学差异。这表明苞叶雪莲水提物中的活性成分能减轻辐射对小鼠生长发育的影响, 对小鼠的造血系统有明显的辐射防护作用, 并能刺激小鼠脾细胞增殖, 改善免疫功能。外周血RBC、Hb含量各照射组差异不明显, 这可能与RBC、Hb代谢周期较长, 造血组织对RBC释放、Hb合成延迟有关。