电离辐射可以导致染色体多种不同类型的畸变, 包括只有两条染色体断裂的DNA双链断裂(DNA double strand breakage, DSB)称简单畸变(simple aberration), 还有3个或4个DSB的复合畸变(complex aberration)。染色体畸变出现的频率依赖于畸变类型、染色体大小、细胞种类和射线的种类、剂量、剂量率, 对各种因素之间大量资料的定量分析可以建立相应的作用模型^[1]。事实上, 长期以来机理性畸变模型已经被广泛使用, 目前的主要任务是分析不同辐射的生物剂量学特点、比较不同DNA修复或错误修复途径、标记间期染色体以及外推低剂量电离辐射生物学效应。笔者主要概述染色体互换型畸变特点、邻近效应(proximity effects)、适用于简单畸变分析的传统数学方法、处理复杂畸变谱的计算机方法、系统地分析复杂互换和使用新软件分析明显染色体不全、畸变传递率以及畸变与其他损伤之间的关系。

1 染色体畸变特点与形成

染色体互换型畸变是DSB自由末端重新结合的结果, 人们经常在细胞分裂间期观察最终突变模式(图 1A), 或在更早的互换形成过程中观察其突变过程来描述(图 1B), 两种都是常用方法, 都有各自的优缺点, 并且均被定量模型所验证。

在细胞分裂间期观察染色体互换最终模式, 主要依赖于多色荧光原位杂交(multicolor FISH, mFISH)或实体染色方法^[2]。利用一些普遍使用的方法建立辐射细胞遗传学数据库, 对不同方法所得结果进行系统比较是十分必要的。方法的不同主要在于它们描述染色体断片的方式不同, 每种方法都有各自的确认染色体断片重接的方式。事实上, 目前很多模型是基于畸变形成过程的(图 1B), 而并非仅仅针对染色体畸变最终模式(图 1A), 尽管很难通过实验来观察染色体突变的形成过程, 但这种方法已由来已久。畸变的形成过程可以系统地描述为一个统一的"畸变多重图", 即显示基因组中DSB部位、重接过程以及染色体重排最终格局。

染色体畸变形成的生物途径包括:①断裂-重接(图 2A)基于非同源末端重接, 涉及在连接位点异源双链的形成。辐射导致的DSB有两个自由断端, 每个自由断端可以和另外一个自由断端重接, 可以形成简单畸变(图 2A(ⅰ))也可以形成复合畸变(图 2A(ⅱ))。②重组错误修复(一击畸变), 基于酶参与的同源重组错误修复。主要的不同是单一一次辐射诱发DSB可以始动一次酶介导的同源错误修复互换。一般情况下, 这种途径形成的DSB自由断端在重组过程中多是同源重组, 从而限制了畸变的类型与频率(图 2B)。③互换, 通过酶参与和Revell型互换原理发生的畸变(图 2C)。畸变谱、剂量-效应关系和哺乳动物细胞G0/G1期辐照所致酶的改变等大量证据表明, 断裂与重接是畸变形成的主要途径。但是, 这一个观点一直有争议, 近来提出了位于转录互换在内的一击畸变^[1]。

2 邻近效应和染色体几何学

无论是上述哪一种途径, 互换需要两个或更多染色体组位点的立体交叉重叠(图 2), 结果可导致中期染色体几何学改变和畸变频率移位等靠近效应, 特别重要的是与DSB结合部位。目前通过生物物理学计算机模式检测技术, 揭示了大量畸变谱, 有助于我们更好地理解间期染色单体结构的特点。当分析靠近效应时, 虽然染色体常常处于随机或多聚状态, 多数都比较粗大, 但是也有很具体的分析模型^[3]。多数由于靠近效应导致的放射所致畸变, 与利用染色体成像技术在染色体特定区域和主要区域表面或远离活跃区域而突出的环等染色体间相互作用区域所观察得到的图像结果是一致的, 然而对高度复合染色体畸变的观察表明更多的畸变则是发生在染色体不同区域。辐照细胞特异mFISH颜色出现频率表明染色体-染色体的交叉很随机, 其它的方法则显示更多系统性染色体空间位置的重叠。

3 经典的畸变定量模型

这里主要综述三种最初用于在辐照后第一个分裂中期检测简单畸变的常用机理性研究方法。

3.1 随机模型(Savage-Papworth公式)

这个模型基于低LET时DSB的发生是随机的, 以及DSB自由末端的错误重接是随机的两个假设。在只有两个DSB(4个DSB自由末端两两错误重接)的特殊情况下, ①双着丝粒、着丝粒或无着丝粒等不对称简单畸变和易位、臂间或臂内倒位等对称互换的几率相等; ②Lucas公式适合单色接点的简单易位。

Savage-Papworth公式预测结果经常与已有资料很接近, 但是:①涂染结果建议把一条染色体的"有效长度"(effective length)作为近似∝(染色体组含量)2 /3而不是∝(染色体组含量), 以避免系统性过高估计大染色体的参与^[4], 表明依赖于染色体组含量的有效长度可能是由于涉及在区域表面的染色单体互换; ②由于染色单体结构改变导致的随机模型的特别偏差(special deviations), 与最近提出的在比较基因组中公认热点有关^[5]; ③假设随机性低估了相对于染色体间互换的染色体内互换。Savage-Papworth认为靠近效应是意味着一对DSB发生在一条染色体上很有可能是错误重接。④高LET时由于DSB簇和靠近效应, 染色体互换畸变谱不同^[6]。体外观察畸变谱中复合畸变率高于简单畸变率, 染色体内断端互换率高, 并且多为不完全互换^[7]。鉴于以上的不同, 确认放射类型和剂量的回顾分析十分必要, 染色体内互换/染色体间互换比率的LET依赖性是非常有争议的^{[8, 9]}。⑤高LET有两个以上DSB时, 下面提到的Monte Carlo法比随机模型更方便。⑥靠近效应可以导致更多的着丝粒或非着丝粒环, 而不是倒位。原因是例如图 1B中DSB的游离端b和c, 在一条染色单体的相反方向, 不仅有重新愈合的可能, 还有可能保持闭合状态, 甚至有些染色体断片自身的两个断端可能连接形成环。因此, 今后的染色体畸变定量模式应该能分辨出这些可能发生的畸变, 尤其是着丝粒环和臂间倒位。

3.2 简单畸变的L-Q公式剂量-效应估算

基于1973年由Chadwick和Leehouts提出的"双元作用理论"(the theory of dual radiation action, TDRA)的线性二次方程(L-Q公式), 是将DNA双链断裂与细胞存活联系起来的数学模型。其中畸变频率Y依赖于总剂量D和剂量率R(t):

(1)

这里假设DSB的两两重接和单指数恢复速率常数λ≥ 0, G是应用于低剂量率和/或分次照射的Lea-Catcheside因子^[10], G≤1, 单次急性照射时G=1。根据能量靠近作用, 对染色体靶的靠近作用和可能发生作用的距离, TDRA通过L-Q参数α和β反应出来。α和β的特性在等式(A)中包括四个主要因素:辐射径迹结构、染色单体几何学、修复和错误修复。虽然L -Q公式有其局限性, 忽视了后来公式中得以改善的复合畸变, α和β参数到目前为止, 绝大部分也只是动物实验的结果, 对人体而言还没有确切可靠的数据, 但是在辐射剂量学中, LQ公式仍是估算剂量-效应的主要模式, 当等式(A)中的λ~ 1 /h时, 得到合理的近似值, 观察直接剂量率效应。

3.3 简单畸变的反应率模型

反应率生物物理模型跟踪时间发展, 应用确定或随机化学质量作用机制公式, 考虑基因管理网络和代谢控制的动力学等式等特殊情况^[11]。多年来研究发现了一些有关简单畸变的反应率模型, 包括图 2B显示的定量机制可饱和修复模型和对应于不同类型DSB双向修复动力学的二损害动力(two-lesions-kinetic, TLK)模型, 每个确定反应率模型有一个对应的随机倒位, 但实际上是源于简单概念性观点, 在许多情况特别是在高LET下是更加准确, 并且可能统计分析细胞-细胞波动。简单畸变的反应率模型在低和中剂量或剂量率通过等式A和B预测L-Q的大致行为, 并且他们的主要应用是解释L-Q参量。在大多数畸变研究中, L-Q估计值对于反应率模型经常是充分的。对于急性大剂量低LET照射形成的染色体畸变, 由于形成的主要是复合畸变, 所以无论是反应率模型还是L-Q估算值都不能准确估算畸变发生率^[12]。

多数辐射生物反应率等式通过混合替代了扩散限制化学动力学, 忽视了靠近效应。靠近作用的简单估计值可以是通过假设细胞核中一些不同的非相互作用区域的相互作用位点的合并。

4 计算机模型 4.1 畸变形成的蒙特卡罗模式

蒙特卡罗模式也称统计模拟模式, 近年来通过蒙特卡罗模拟获得的大量实验数据, 进一步完善了致畸方法。模拟实际上是利用计算机rolling dice效应给出一个非常详细的数据。例如急性低LET辐照, 染色体畸变模拟(chromosome aberration simulator, CAS)软件, 首先, 通过使用一台随机数发生器, 在一个细胞1号染色体上随机确定DSB发生位点, 其他45条染色体也通过同样方式来处理, 同时考虑他们的DNA含量。其次, 根据染色体畸变的任何途径(图 2)模拟DSB自由末端的愈合或者错误重接, 通过离散马尔可夫方法来考虑靠近效应。指定相应的计数方法, 然后确定一被模仿的核型。大量重复模仿分裂中期的每一可能的畸变模式。然后, 将计算机模拟得到的结果与试验观察得到的畸变谱和剂量反应关系进行比较。这种方法强调了畸变的主要过程和可能的结果, 有可能低估但是没有完全忽略次要的畸变形成过程和可能的畸变类型。可以完全模拟复合畸变, 例如将分析畸变谱作为辐照质量的生物标志物。

CAS虽然可用于分析α粒子导致的畸变, 但是主要是应用于低LET诱发的畸变。另外, 还研发了一些分析染色体断裂和错误重接的应用软件^[6], 这些程序更现实和全面地考虑了高LET辐照, 但是对于复合畸变未给出系统描述。Moiseenko和他的同事提出的蒙特卡罗模式的优势是追踪实际的时间影响, 而不仅仅是顺序^[13]。

4.2 周期结构复合畸变定量

一个完全交换类型染色体畸变不涉及不可预测的拟DSB形成过程。例如, 一个简单的畸变形成涉及两个DSB反应, 比如2个周期c2, 图 2Aⅱ所示3个周期c3;图 1B涉及两个分离反应, 一个包括两个DSB(cd和gh)、一个包括3个DSB, 所以周期结构为(c2 +c3)等等。一个可观察的畸变模式经常是兼容许多不同的畸变形成过程, 有各种各样周期结构, 然后"强制"选定最短的周期结构^{[14, 15]}。例如图 1A中, 最终5个DSB的形成模式有4种可能。如图 1B所示, “强制”周期结构(c2 +c3), 另外的3个过程选定的是c5, 表明在每一种情况下, 一个简单的过程有更为复杂的互换。当观察的错误重接数量达到10个或更多, 那么他的形成过程就有很多种可能性, 近来研发的软件可用于分析该复杂过程^[14-16]。比如说对于多色复合荧光原位杂交(mFISH)模式(1′::3::2′) (4::1)(2::3′)(3::1′::4′)(1::1)(:1:)(:2::1:), 这里的括号内显示了不同的染色体重排, 数字代表颜色, 质数代表着丝粒, 两个冒号代表错误重接, (:1:)和(:2::1:)代表环。假设没有同形错误重接, 软件分析有1, 152种可能的形成过程, 其中55.6%(640 /1, 152)是“强制”选定周期结构c10, 仅1.4% (16 /1, 152)是“强制”周期结构(c2 +c4 +c4)。这个例子说明一个普遍现象就是假设“强制”周期结构趋向于低估复合畸变。对于更复杂的模式11个错误重接(1′::3::2′)(2:: 1)(2′::3′)(3::1′::2′)(1::1)(2::2)(:1:)(:2::1:), 有20 736种可能的形成过程, 其中仅0.15% (32/20, 736)是“强制”周期结构(c2 +c3 +c3 +c3), 而50% (10, 368 /20, 736)是“强制”周期结构c11。蒙特卡罗抽样可替代这样的周期统计列举, 主要应用于有大于1 000 000种形成可能的复杂畸变。

4.3 明显残缺不全的畸变模式

许多观察到的畸变模式看上去残缺不全, 有可能是实际上一些DSB自由末端没有重接或者是因为一些染色体断片为同形错误重接, 这两种情况的不同可以通过端粒探针来分析^[17-19]。在复杂的情况下, 对于明显残缺不全、完全或确实残缺不全的畸变是很难判断的。现在已经通过研发相应的软件分析任何一条整条染色体的涂染(如mFISH)来系统地解决这个问题。简单地说, 就是首先考虑一种颜色, 设定T代表明显的端粒和C代表涉及的着丝粒(C> 0);每种颜色T < 2C, 被观察到的畸变模式是(2C-T), 即“同形末端”减去有一个端粒和另一末端未重接或错误重接的无着丝粒小片断; 每种颜色T>2C, 明显的端粒被实际上形成的DSB自由末端替代。明显残缺不全、完全或确实残缺不全畸变可以通过下面的方法来系统地计算。一是考虑自由末端中的两两错误重接, 或者一些这些自由末端的未重接, Levy的软件^[16]可用于分析这些复杂情况, 如周期结构可能系统地解决。

5 细胞增殖和畸变可传性

分析畸变行为和畸变细胞有丝分裂十分重要, 主要的定量公式有Carrano和Heddle公式, 公式中涉及的参数是根据体外辐照后第一次细胞分裂来确定的。一个参数是W, 即一个简单的双着丝粒体形成子体的可能性, 另一个参数是无着丝粒可传性参数T, 即2T指定一个携带无着丝粒细胞可至少传递一个无着丝粒断片到另一个细胞。对于人类淋巴细胞W =0.42, T =0.41^[16]。这种方法已经通用到更为复杂的复合畸变、后期的分裂和活体^[20]。然而, 由于辐照可导致细胞染色体不稳定性, 所以需要建立新的定量估算模型^{[21, 22]}。

6 其他终点的相关畸变

近来的结果表明, 在标准的突变分析中多数全基因或多个外显子缺失是通过本质相同的互换型畸变错配过程形成^{[23, 24]}, 并且许多癌症的起因与特定的染色体互换畸变有关^[25]。但是, 互换型畸变往往需要超过1个DSB才能形成(图 2), 与辐照导致其他终点的相关畸变明显不同。几Gy的低LET急性照射时, 多数体细胞的致死性是由于双着丝粒和环等互换型畸变导致。然而, 对于低剂量或低剂量率照射来说, 更多的畸变不是导致致死性而是导致最多一个DSB的小范围损伤。

7 结语

利用现代计算机生物技术进行畸变研究, 有助于揭示潜在的生物物理修复/错误修复机制和中期染色体几何学。目前的研究热点包括外推低剂量作用机制、体内畸变可传性模型化和染色体不稳定性模型化。今后的研究方向包括:①染色体畸变谱模型化, 做为辐射特性的指纹图谱; ②通过更加逼真的染色体几何学、细胞核结构、染色体运动、特别是DSB错误重接模型, 合并细小径迹结构模型; ③更加系统地模型化染色单体畸变; ④扩展早熟染色体凝集(premature chromosome condensation, PCC)模型, 因为畸变的形成过程比最终的畸变构型更重要; ⑤需要建立大范围染色体组改变的定量模型, 如肿瘤细胞遗传学中的复制和非整倍体、比较基因组中端粒融合等, 这就需要进一步一体化辐射细胞遗传学和其他相关学科; ⑥澄清畸变与其他常见损伤的生物学意义。