电离辐射可诱发细胞发生细胞周期阻滞, 受照射细胞可因细胞种类, 受照射的周期时相以及射线种类不同等, 而在细胞周期阻滞时相, 阻滞程度和阻滞过程等方面有所不同。研究表明:多糖可减轻电离辐射所致正常细胞G1期阻滞和S期延迟。本实验采用2Gyγ射线照射小鼠为模型, 观察琼枝麒麟菜多糖(Eucheuma gelatinae polysaccharide, EGP)对照射小鼠细胞周期的影响, 以探讨EGP对辐射损伤小鼠细胞周期的影响, 为麒麟菜多糖成为临床抗辐射药物提供证据。

1 材料和方法 1.1 动物

昆明种小鼠50只, 雄性, 6~8周龄, 体重(20±2)g, 由广东医学院实验动物中心提供。

1.2 材料来源

EGP从海南产琼枝麒麟菜中提取, 藻体经95℃水浴提取、醇沉淀及流水透析后真空干燥制得, 由红外光谱鉴定呈β -糖苷键型特征吸收峰, 醋酸纤维薄膜电泳检测为电泳纯, 硫酸-酚法测得总糖含量为83%。

1.3 主要试剂及仪器

RPMI-1640培养液(Gibco, 美国), 小牛血清(Hyclone, 美国), 碘化丙锭(PI)染液; 流式细胞仪Coulter, 美国)。

1.4 照射条件

⁶⁰Coγ射线一次性全身均匀照射, 照射距离为80cm, 剂量率为0.673Gy/min, 吸收剂量为2Gy。

1.5 分组处理

小鼠随机分为正常对照(A)组、模型(B)组和3个不同浓度EGP加照射(C、D、E)组, 每组10只。C, D, E组分别以3个不同剂量(100, 200和400mg·kg^-1·d^-1)分别给予, 按0.1ml·(10g)^-1灌胃, 连续10d;A组和B组均用等量生理盐水灌胃; 停止灌胃20h后行一次性γ射线全身照射(正常对照组不照射)。

1.6 胸腺(脾)细胞悬液制备

照射后20h小鼠断头处死, 无菌条件下取出胸腺和脾脏分别置于盛有RPMI-1640培养液的培养皿中, 毛玻片研磨后, 用200目不锈钢网滤出单细胞悬液, 经Hanks液洗2次(1 000r/min, 5min)后用RPMI-1640培养液调细胞浓度至1 ×10⁷/ml(胸腺细胞)和5 ×10⁶/ml(脾细胞)。

1.7 骨髓细胞悬液的制备

照射后24h断头处死小鼠, 从大腿部取出股骨, 剪去两端, 用注射器吸取0.5ml小牛血清冲洗骨髓腔, 用带有7号针头的注射器反复吹打, 使细胞充分分散, 1 000r/min离心10min, 弃上清液, 用移液器吹打分散细胞。

1.8 细胞周期检测

将70%冷乙醇固定的单个脾细胞, 胸腺细胞和骨髓有核细胞悬液以1 000r/min离心5min, 弃乙醇, 用磷酸盐缓冲液(PBS)洗细胞2次, 用震荡器震散细胞, 加入1ml碘化丙锭染液(50mg/l), 混匀, 30min后上机测定。

1.9 统计学处理

实验数据用x±s表示, 用SAS8.2统计软件进行单因素方差分析。

2 结果 2.1 EGP对胸腺细胞周期的影响

从表 1中可看出, B组小鼠G₀/G₁期胸腺细胞百分数明显高于A组(P < 0.01), 而S期和(M+G₂)期胸腺细胞百分数明显低于A组(P < 0.01);C, D, E组小鼠的G₀/G₁期胸腺细胞明显百分数明显低于B组, 而S期和(M+G2)期胸腺细胞明显高于B组(P < 0.01)。

2.2 EGP对脾细胞周期的影响

从表 2中可看出, B组小鼠G₀/G₁期脾细胞百分数明显高于A组(P < 0.01), 而S期和(M+G₂)期脾细胞百分数明显低于A组(P < 0.01);C, D, E组小鼠的G₀/G₁期脾细胞明显百分数明显低于B组, 而S期和(M+G₂)期脾细胞明显高于B(P < 0.01)。

2.3 3EGP对骨髓细胞周期的影响

从表 3中可看出, 从表 2中可看出, B组小鼠骨髓G₀/G₁期细胞百分数明显高于A组(P < 0.01), 而S期和(M+G₂)期骨髓细胞百分数明显低于A组(P < 0.01);C, D, E组小鼠的G₀/G₁期骨髓细胞明显百分数明显低于B组, 而S期和(M+G₂)期骨髓细胞明显高于B组(P < 0.01)。

3 讨论

辐射可引起多种细胞如酵母和动物细胞周期的紊乱, 包括G₁期阻滞、S期延迟和G₂期延迟。Yamada等在0.34~1.35Gy照射HeLaS3, 发现G₂期延迟, 未发生S期延迟。但对同步于不同时相的细胞分析表明, 细胞在G₁期受照, G₂期延迟最少, G₂期受照, G₂期延迟最大, 而S期受照者G₂期居中, 同时也观察到S期延迟。在小鼠L细胞中, 首次观察到在2.2和5.8Gy照射后, G₁期阻滞的发生。随后在人骨髓细胞和人胎盘羊膜二倍体成纤维细胞中也观察到照射后引起细胞G₁期阻滞的现象^[2-3]。

辐射也可引起小鼠胸腺和脾细胞细胞周期的紊乱, 大量实验证明多糖可减轻电离辐射所致正常细胞G₁期阻滞和S期延迟。孟庆勇等发现半叶马尾藻多糖可缓解辐射小鼠G₀/G₁期胸腺细胞阻滞, 增加G₂/M期DNA合成^[4]。电离辐射同样也可以致脾细胞发生G₁期阻滞和S期延迟, 严重干扰该组织的功能。照射对照组小鼠接受2Gyγ射线后, 发生了明显的脾细胞发生G₁期阻滞和S期减少, 但半叶马尾藻多糖加照射组脾细胞G₁期阻滞和S期减少和程度与照射对照组比显著减轻, 而且半叶马尾藻多糖对受照小鼠的上述指标的降低程度与用药剂量呈正相关^[5]。叶飞等^[6]用流式细胞术研究黄蘑多糖对受照小鼠胸腺细胞周期进程的影响, 结果显示, 给药组S期细胞明显高于对照组, 而G₀/G₁期细胞则显著低于对照组, 说明黄蘑多糖具有加速胸腺细胞从G₀/G₁期进入S期的作用, 从而加速DNA合成, 增强机体的免疫功能的影响。本研究显示:2Gyγ射线全身照射后, 脾细胞、胸腺细胞出现明显G₁、G₂阻滞, S期明显受抑, 预防给予小鼠琼枝麒麟菜多糖脾细胞和胸腺细胞细胞周期率明显改变, 表现为实验组小鼠脾和胸腺S、G₂+M期细胞比模型组明显增加, 说明琼枝麒麟菜多糖可促进脾脏、胸腺细胞的分裂增殖, 从而使受射线照射损伤细胞得到快速修复。表明不同种类的多糖抗抗辐射的机制的共性。

骨髓细胞周期紊乱是电离辐射造血损伤的另一个特征, 中等剂量电离辐射可诱导小鼠骨髓细胞发生G₁期阻滞^[7]。G₁期阻滞是机体对外界刺激的一个保护性反应, 可提供充足的时间来促使受损伤的DNA在进入DNA合成和复制的S期前得以修复。损伤严重者可通过凋亡等方式除掉DNA异常的细胞, 从而降低了基因组的不稳定性, 减少了肿瘤的发生^[8]。但G₁期阻滞会造成骨髓细胞增殖不良, 无法维持正常的造血功能。因此, 解除骨髓G₁期阻滞, 使骨髓G₁期细胞重新进入S期, 是拮抗骨髓辐射损伤的重要途径^[9]。本研究结果显示, 2Gyγ射线全身照射后24h, 小鼠骨髓G₀/G₁期细胞明显增多, 而S期和G₂/M期细胞明显减少, 说明2Gyγ射线照射导致小鼠骨髓细胞发生G₁期阻滞, 细胞进入S进程受阻。照射前给予琼枝麒麟菜多糖可明显提高S期和G₂/M期骨髓细胞, 减少G₀/G₁期细胞。控制细胞周期分子机制的核心为细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs), 其中CDK4、CDK6被认为在G₁期阻滞中起关键作用^[10]。研究表明CDK4激酶活性的降低在电离辐射诱导的细胞周期G₁期阻滞中起关键作用, 提高CDK4表达可通过中和p21从而使CDK4、CDK2保持激酶活性, 进而抵抗辐射诱导的G₁期阻滞^[11]。海藻多糖对辐射损伤小鼠骨髓细胞G₁期阻滞有一定的缓解作用, 其作用机制可能与提高CDK4蛋白表达有关。