鲨鱼是一种特殊的海洋生物, 早在1500年前民间就已用于防治疾病。最早从鲨鱼软骨中提取的药用成分为硫酸软骨素D, 主要用于治疗心血管疾病。近年来国内外学者对鲨鱼软骨及其制剂进行了广泛和深入的研究。鲨鱼软骨中含有大量胶原蛋白、粘多糖、抗癌特效因子CDI和丰富的磷、钙以及微量元素等等, 对人体非常有益[1]。其中, 鲨软骨中的粘多糖, 有很强的生理功能, 例如抗凝血、降血脂、抗病毒及抗肿瘤等作用, 是重要的海洋保健食品和药品原料[1, 2]。因此, 对鲨鱼软骨粘多糖的研究已经成为国内外研究的热点, 对其结构、组成、药理以及应用等方面进行了大量的研究, 近年来发现鲨鱼软骨成分还可以激活免疫系统。本研究初步观察了鲨鱼软骨粘多糖对辐射损伤小鼠的免疫器官及生殖器官的保护作用。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 主要仪器MEK-5216型血细胞计数仪, 购自日本, Olympus显微镜, 购自日本。
1.1.2 实验动物雄性ICR小鼠, 19~21g, 购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司, (许可证号:SiXK(沪)2003-0002)。
1.1.3 鲨鱼软骨粘多糖的制备新鲜鲨鱼软骨由浙江省乐清市海洋生物保健品有限公司提供, 高速组织匀浆后, 加入胰蛋白酶水解, 高速离心后得上清, 加入3倍95%乙醇沉淀过夜, 离心取沉淀, 冷冻干燥得白色可溶于水的鲨鱼软骨粘多糖。
1.2 方法 1.2.1 分组及方法取ICR雄性小鼠50只, 体重19~21g, 随机分为正常对照组(给予蒸馏水, 不照射)、模型对照组(给予蒸馏水, 照射)和低、中、高三个剂量的鲨鱼软骨粘多糖组, 每组10只。每天灌胃给药, 给药体积为0.4ml/20g, 阴性和模型对照组灌同体积的蒸馏水, 每天1次, 期间动物自由摄食和饮水。灌胃2周后所有动物眼眶后静脉纵取血进行白细胞计数, 第二天除正常对照组外, 各组均以0.83Gy/h60Coγ射线进行一次全身照射, 照射剂量为5Gy, 照射后各组小鼠继续每天1次灌胃, 继续灌胃14d。
1.2.2 测定指标① 白细胞计数:各组动物分别于照射前1天、照射后3d、照射后14d测小鼠体重后, 眼眶后静脉纵采血20μL, 用血细胞计数仪测外周血白细胞数。②脾指数和胸腺指数:照射后第14天测体重, 摘眼球放血后脱颈椎处死小鼠, 分离脾脏和胸腺, 称重计算脾指数和胸腺指数。③骨髓有核细胞计数:剥离出小鼠右侧完整股骨, 用3%醋酸10 ml反复冲打骨髓内细胞, 过滤后, 在血球计数板上计数每根股骨中有核细胞数。④睾丸的重量指数及畸形精子数:取小鼠左侧睾丸、副睾称重, 计算睾丸指数, 将副睾剪碎, 计数精子数, 并将精子涂片, 2%伊红染色后计数畸形精子数, 计数1 000个精子中精子畸变率。
1.2.3 统计学处理以双侧, Student' st检验方法对所得数据进行统计学分析, 每个实验至少重复3次。
2 结果 2.1 鲨鱼软骨粘多糖对辐射小鼠体重的影响模型组在照射后3d和14d, 体重均较正常对照组明显下降(P＜0.05), 而鲨鱼软骨粘多糖在照射后3d各给药组及照射后14d高剂量组体重有所下降(P＜0.05), 其余各组及其他时间均与正常对照组无统计差异(P＞0.05), 表明鲨鱼软骨粘多糖可能对辐射小鼠的体重有一定的保护作用。见表 1。
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表 1 鲨鱼软骨粘多糖对辐射小鼠体重的影响(g) |
小鼠辐照后3d, 模型组及鲨鱼软骨粘多糖各给药组的白细胞数与正常对照组比较均显著下降(P＜0.01)。照后14d, 各受辐照组白细胞数虽较照后3d有所上升, 但与正常对照组相比, 差异有显著性(P＜0.01)。鲨鱼软骨粘多糖中、高剂量组在照后3d及14d白细胞数明显高于模型组(P＜0.05)。见表 2。
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表 2 鲨鱼软骨粘多糖对辐照小鼠白细胞数影响(×109/L) |
辐照后第14d, 模型组的胸腺指数及脾指数均明显低于正常对照组, 三个剂量的鲨鱼软骨粘多糖组的胸腺指数及脾指数与正常对照组相比则没有统计学差异。中、高剂量的给药组的胸腺指数和高剂量组的脾指数均明显高于模型组(P＜0.05), 小鼠受辐照后第14天, 模型对照组的骨髓有核细胞数(BMNC)明显低于正常对照组, 而三个剂量的鲨鱼软骨粘多糖组的BMNC与正常对照组没有统计差异, 且中、高剂量组的BMNC均明显高于模型组(P＜0.05)。表明一定浓度的鲨鱼软骨粘多糖对辐射小鼠的免疫器官和骨髓损伤有一定的保护作用。见表 3。
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表 3 鲨鱼软骨粘多糖对辐照后14d小鼠胸腺、脾脏指数及骨髓有核细胞 |
辐射照后第14天, 模型组的睾丸重量指数、精子总数及精子畸形率均明显低于正常对照组。在给药组中, 低剂量和中剂量组的睾丸重量指数低于正常对照组(P＜0.05), 低剂量组的精子总数低于正常对照组(P＜0.05), 高剂量组的睾丸重量指数及中、高剂量组精子总数与正常对照组差异无显著性(P＞0.05)。中剂量组的睾丸指数和高剂量组的睾丸指数、精子总数明显高于模型组(P＜0.05), 中剂量和高剂量组的精子畸形率显著低于模型组(P＜0.01), 表明鲨鱼软骨粘多糖对辐射造成的小鼠生殖系统损伤具有保护作用。见表 4。
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表 4 鲨鱼软骨粘多糖对辐照后14d小鼠睾丸指数、精子总数及精子畸形率的影响 |
鲨鱼是世界上最古老、最长寿的深海海洋生物之一, 也是软骨鱼中最重要的一类。美国科学家经过数十年发现鲨几乎不患癌症, 对癌症有天然免疫力。我国是世界上最早对鲨鱼开发应用的国家, 鲨鱼的药用在我国始见于《本草经集注》, 依托传统中医中药, 积累了丰富的药用经验, 诸多医籍不乏记载。在西方, 直到上世纪70年代初才发现鲨鱼软骨的药用价值。
近年来发现鲨鱼软骨成分中还含有丰富的胺基糖、粘多糖和高效的抑菌酶, 鲨鱼软骨粘多糖是在动物生存过程中生成, 并在完成动物功能上起着重要作用的物质。一般认为鲨鱼软骨粘多糖的药物活性有以下几点:①具有抗凝血作用[3]。②有阻滞脂蛋白透过动脉壁的作用[4, 5]。③具有抗炎症和抗病毒的作用。④鲨鱼软骨素具有抗动脉硬化的功效[6]。⑤酸性粘多糖具有一定抗肿瘤活性[7, 8]。⑥可以激活免疫系统, 提高免疫能力[9]。王劲等[10]研究也表明, 鲨骨粉具有一定的扶正作用, 可明显提高荷瘤小鼠的NK细胞活性和巨噬细胞的吞噬功能。李东霞等[9]研究发现, 鲨鱼软骨多糖对胸腺和脾脏具有刺激作用。
本研究结果显示, 鲨鱼软骨粘多糖提取物可提高受辐照小鼠的体重, 使辐照后3d高剂量组小鼠外周血白细胞数明显高于模型组, 且辐照后14d小鼠的胸腺指数及脾指数明显高于模型组, 使受辐照小鼠的骨髓有核细胞数明显高于模型组, 表明鲨鱼软骨粘多糖提取物对辐射损伤小鼠的免疫器官及其功能具有一定的保护作用, 说明鲨鱼软骨粘多糖可以激活免疫系统, 活化T、B细胞和巨噬细胞, 明显增强骨髓的造血功能和对胸腺和脾脏的刺激作用, 提高机体的免疫功能, 这也进一步证实了李东霞等的研究。本研究结果还显示, 鲨鱼软骨粘多糖提取物高剂量组可明显提高辐射损伤小鼠的睾丸重量指数, 精子总数及降低辐照小鼠的精子畸形率, 表明鲨鱼软骨粘多糖提取物对辐射损伤小鼠的生殖系统也具有一定的保护作用。
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