淋巴细胞微核测试法在辐射领域内已得到广泛的应用, 它是除染色体畸变分析外, 早期估算受照剂量的又一较可靠的生物学方法, 它具有方法简便、易于掌握等优点, 已被用作估算受照剂量和评价辐射远后效应的重要指标。笔者对"6.25"钴源事故中的3例受照人员进行了照后17a的随访观察。

1 材料和方法 1.1 血样

3例病人"龙"、"俊"、"军"照后17a, 抽取静脉血, 肝素抗凝。置于等体积RPMI1640培养液内, 低温条件下运到本实验室, 取血16h后开始培养。

1.2 淋巴细胞培养

MN制片取0.3 ml肝素抗凝血, 加入到RPMI1640组合培养液(含20%的新生小牛血清)3 ml中, 加适量PHA, 置37℃温箱培养44h, 加入松胞素B, 使最终浓度为6μg/ml。继续培养至72h制片。依次轻微低渗, 固定、制片、Giemsa染色。

1.3 镜检分析

双核淋巴细胞是经过一次核分裂而胞浆未分裂的淋巴细胞微核(MN)率是100个双核细胞中的MN数。微核辨认的标准:主核及MN均位于胞浆内; MN的直径小于主核的1/3;呈圆形或近圆形; 无折光性; 着色与主核一致, 稍浅或稍深; 在较大的MN中可见到染色质结构; 主核与MN互不相连, 如有重叠或切迹, 需清晰地看到各自完整的核膜; 只分析胞浆完整的细胞。

2 结果

表 1列出了3名受照者的MN和微核细胞(MNC)检出结果。由表 1可见:3名受照者的MN和MNC率均高于正常参考值(MN率1.58%;MNC率1.40%)^[1]。

由表 2可见:MNC中的MN出现频率仍与早先受照剂量相关。含2个以上的MN的MNC数以受照剂量最大的"龙"最高, "俊"次之, 而受照剂量最低的"军"则以含一个MN的MNC为主。

为了解MN在体内的衰减规律, 将本次结果与照后5a和10a^[2]的MN检出结果进行比较, 结果见表 3和表 4。从表中可见, 照后第17年的MN率和MNC率虽然低于照后第5年, 但高于照后第10年的结果。

3 讨论 3.1 MN及MNC率的变化特点与机体的损伤修复关系

从本次检测结果发现, 3例病人的MN和MNC率照后17a仍高于正常参考值(MN率1.58%;MNC率1.40%), 说明损伤至今尚未修复。

照后17a3名受照者MNC中以含一个MN的MNC为主。在≥ 2个MN的MNC中, "龙"最高, "俊"次之, "军"则主要是一个MN的MNC, 这与当时3人受照剂量与损伤程度相符的, 龙"的受照剂量大, 当时检出的≥ 2个MN的MNC高, 目前残存的仍高。3例病人在照后17a过程中, 由于受损伤细胞的死亡、修复、MN丢失等因素, 与受照时相比MN及MNC已明显减少^[2], 而且减少的MNC以含2个以上MN损伤较重的MNC为主, 保留下来的则以损伤较轻的含一个MN的MNC为主。分析其主要原因是:畸变细胞是不健康的细胞, 而一个畸变细胞中含畸变数的多少与该细胞的损伤程度有关, 一些损伤较重的MNC很快死亡并从循环中消失; 一些损伤较轻的MNC在分裂过程中将MN丢失; 另一些损伤较轻的MNC在分裂时MN未能丢失, 最后寿终正寝。因此损伤较轻且含MN的那些长寿命的淋巴细胞将长久的存在于血循环中而随时可被检出。

3例病人照后10a中, MN及MNC率是逐渐下降的, 而照后第17年的MN率和MNC率虽然低于照后第5年, 但却高于照后第10年。原因可能是微核源于染色体的无着丝粒断片, 为不稳定型畸变, 停止照射后, 由于断片丢失, 细胞死亡、淋巴细胞的转换更新, 致使MN和MNC率不断下降。照后第17年的MN率和MNC率再次升高, 可能是随着年龄的增长, 微核的自发率也在以每年4.3%比率增加^[1]; 另外实验室之间的方法学误差也在考虑之中。除了上述原因也不排除由于机体曾被照射, 免疫功能受损、更易受病毒的侵袭及各种环境诱变因素的影响, 从而诱发新的MN形成也是导致MN及MNC率增高的原因。

另外从微核的来源分析, Degrassi^[3]在1998年的实验表明电离辐射诱发的微核主要来自染色体断片。Titeuko^[4]在1994年将带有荧光标记的着丝粒探针进行原位杂交, 可区别含着丝粒的微核和无着丝粒的断片。也有许多学者注意到, 微核的形成与染色体的脆性部位有关。在我们同时进行的染色体检测结果表明, 3例受照者染色体的非稳定性畸变基本消失, 而受照者17a后外周血中的淋巴细胞微核率依然高于正常。这是否说明微核的来源不只是染色体断片, 还存在间期细胞核以核牙突方式形成的微核?国内学者薛开先^[5]于1986年采用放射自显影、间期细胞和各周期微核定量分析等手段, 提出了间期细胞可以以核牙突方式形成微核学说, 曹佳^[6]使用Brdu标记和电镜技术也证实了这一途径可以解释部分微核的形成。本研究中的3例受照者的微核是否也有来源于间期细胞核牙突形成的, 还有待于进一步的实验研究。

对于淋巴细胞微核率持续升高会导致什么后果及其临床意义如何, 与致癌、遗传等远后效应有无联系值得继续随访、观察积累资料加以阐明。

3.2 MN检测的临床意义

微核法是检测致突变物、致癌物的主要手段之一, 是致癌危险性及其他遗传危害的短期测试的有效方法, 因此在临床的研究中得到广泛的应用。体细胞突变学说在致癌机制中受到广泛的支持。突变往往造成染色体损伤, 而微核检测又是染色体损伤的一个敏感指标, 因此人们认为把微核检测作为早期致癌危险性监测指标是有价值的。Znaor A^[7]等对200个职业受照工人的随访中, 发现工人的微核率高达49‰, 已确诊的4例癌症病人, 有3例病人微核率较高。为此作者建议将微核检测作为职业人员癌症检测的一个筛选指标。Joseph LJ^[8]等的研究也提到在系统性红斑狼疮、全身硬化症、糖尿病及癌症等疾病中, 观察到微核率显著增高。现在日本也有学者将微核分析作为指导肿瘤放化疗的指标之一。

人外周血淋巴细胞、实体组织活检细胞、组织脱落细胞的微核率在一定程度反映射线及外来化合物对某些器官造成遗传毒性损害, 对肿瘤的研究、诊断有较大的参考价值。随着免疫荧光技术和原位杂交技术的发展, 着丝粒和端粒DNA探针、染色体特异性文库DNA探针的应用, 大大拓宽了微核实验的研究内容, 可检测染色体断裂、染色体丢失、染色体的不分离、细胞分裂延迟和调亡等多个终点^[9]。尤其近年研究表明, 非整倍体与流产、畸形、智力发育障碍和癌肿发生密切相关。通过微核实验, 区分微核来源于整条染色体还是染色体断片, 可实现对非整倍体的检测; 而常规非整倍体实验只能观察细胞中期的染色体数目变化, 不能区分哪些染色体是遗传损伤的靶, 也不能检测某些非整倍体。微核实验现已成为可检测多终点的分子毒理学方法, 在非整倍体毒剂检测、致突变物筛选和外来化合物生物毒作用机制研究领域得到广泛应用。