虽然不同病因的急性肾功能衰竭(ARF)有某些特殊的发病机制, 但肾血流动力学的异常是ARF发病的共同基础^[1]。近年来, 对ARF发病、修复的机理研究比较多的是缩血管活性物质-血管内皮素-1(ET-1), 但对体内最强大的舒血管物质降钙素基因相关肽(CGRP)的研究尚少^[2]。笔者探讨了肌注甘油诱导大鼠ARF不同时间CGRP和ET-1的变化及静脉注射CGRP对ARF的影响和作用。

1 材料与方法 1.1 动物与主要试剂

雄性健康Wister大白鼠136只, 体质量180~250g, 代谢笼饲养。主要试剂CGRP粉剂购自Sigma公司。

1.2 方法

大鼠随机分成实验组、治疗组和正常对照组; 实验组、治疗组每组8只老鼠, 每组老鼠分8个时相点(1h、3h、6h、12h、24h、48h、72h和7d)。实验组:大鼠禁水16h, 肌注50%甘油^{[3, 4]}; 治疗组:大鼠禁水16h, 肌注50%甘油出现血尿5~10min后, 尾静脉注射浓度为1μg/ml/100mg的CGRP; 正常对照组:8只大鼠, 正常饮水吃食。因正常对照组大鼠血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)等生化指标24h波动不大, 故取24h指标^[2]。

1.3 检测指标 1.3.1 生化指标的标本采集及检测

实验组及治疗组各时相点(正常对照组随机处理)采集动脉血和24h尿量。利眠新麻醉剂, 按照0.05~0.1ml/100g剂量肌肉注射。麻醉后剖腹分离大鼠腹主动脉, 采血4~5ml, 将1.5~2.0ml血样置于干管中, 常温离心后吸取300μl血清, 检测肾功能的各项生化指标, 分别为血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)、血钙(BCa²⁺), 尿肌酐(Ucr)。根据血肌酐、尿肌酐和24h尿量计算出内生肌酐清除率(Ccr)。以上生化指标由我院检验科德国Backman ASTRA-8型自动生化仪测定。

1.3.2 ¹²⁵I放免测定标本预处理

另取1.5~2.0ml血放入抗凝离心管(10% EDTA30μl和4万u/ml抑肽酶40μl)中, 低温离心(4℃, 3000~4000r/min)15min后, 各吸取血浆500μl置-20℃冰箱保存, 用作CGRP、ET-1放免检测。

1.3.3 放免检测步骤

将上述标本分别与CGRP、ET-1抗血清均匀混合, 4℃孵育24h, 次日加入¹²⁵I标记的CGRP、ET-1标本再次4℃孵育过夜, 第3天加入PR试剂混匀, 37℃静置1h, 低温离心20min, 取上清夜在γ计数器上测定沉积cpm值。再用放免数据处理软件包计算出样品内CGRP、ET-1含量, 以pg/ml表示。CGRP、ET-1放免试剂盒由解放军总医院东亚免疫技术研究所提供。

1.4 统计学处理

对各组血液生化检查指标, CGRP、ET-1的¹²⁵I放免测定数据等, 均采用Stata统计分析软件7.0版, 数据以均数±标准差(x±s)来表示, 显著检验用方差分析。

2 结果 2.1 肾功能改变 2.1.1 肾生化指标的变化(表 1)

如表 1所示, ①实验组1h~72h大鼠SCr与BUN值均较正常组显著升高(P < 0.01), 尤以24h组为著; 24h~72h时Ucr值则明显下降; BCa²⁺值在1h~72h时组较正常对照组明显降低; Ccr在24h后较正常组极显著下降(P < 0.01)。②治疗组SCr与BUN在48h后与正常对照组差异无显著性(P>0.01)。Ucr在72h后与正常对照组差异无显著性(P>0.01)。Ccr在24h后较正常组显著下降(P < 0.01)。③治疗组SCr与BUN在12h后较ARF组极显著减低(P < 0.01)。Ucr在72h后较实验组显著增多(P < 0.05)。Ccr在24h后较正常组显著增高(P < 0.01)。

2.1.2 实验组和治疗组24hBUNScr值比较变化(图 1, 图 2)

图 1所示:治疗组BUN在1-3h与实验组差异无显著性, 12~24h较实验组显著降低(P < 0.01)。如图 2所示:治疗组SCr在1-3h与实验组差异无显著性, 12~24h较实验组显著降低(P < 0.01)。

2.2 ¹²⁵I放免检测损伤组血浆中CGRP、ET-1含量结果(表 2, 图 3)

由表 2可看出ARF时CGRP、ET-1的变化规律:①血浆CGRP水平在实验组1h、3h较正常对照组极显著升高, 以3h最高, 24h降低到最低点, 较正常对照组差异有显著性(P < 0.05)。72h和7d, CGRP则于正常对照组差异无显著性; ②血浆ET-1水平实验组1h、3h、24h逐渐升高, 较正常对照组差异有显著性(P < 0.01)。如图 3所示:①实验组1h血浆中CGRP含量无明显变化, 3h较正常组有显著升高(P < 0.05), 24h下降到最低, 较正常组有极显著意义(P < 0.01)。72h有所回升, 但仍较正常组有显著下降(P < 0.05), 7d逐渐恢复, 接近正常。②实验组1h血浆中ET-1较正常组含量极显著升高(P < 0.01), 并达到最高峰。3h、24h虽略有下降, 然仍维持较高水平(P < 0.01), 72h后恢复正常。

3 讨论

(1) 本研究表明大鼠在急性肾缺血时血浆CGRP水平可增加几十倍, 这些都可能是机体对缺血损伤的一种代偿反应^[6]。从大鼠ARF的实验中可以看出CGRP的动态变化, 在病程初期血浆CGRP较正常对照组升高, 以实验组3h升高最为明显, 表明对ET-1有拮抗作用, 可调节肾脏肾血流量, 当CGRP不足以拮抗ET-1释放的生物效应时, 病情则会继续加重, 这可以从24h实验组血浆中CGRP明显下降及肾功能损伤各项指标明显上升中反映出来; 实验组72h和7d血浆中CGRP含量与正常对照组无明显差异, 这与血浆中CGRP恢复有关, 对肾功能的好转有利。ARF大鼠血浆中CGRP、ET-1含量的变化可以反映出ARF的病程发展, 并提示检测血浆中的CGRP和ET-1是ARF病情转归的敏感指标。

(2) 内源性的扩血管物质生成减少与ARF整个发病过程中的血流动力学的改变有关。CGRP是体内已知最强的扩血管物质^[3], 在调节血管外周阻力中起重要作用, 有减轻组织缺血损伤, 增强细胞防护功能的生物学效应^[4]。CGRP对肾脏的保护作用与其在生理和病理中的作用是分不开的。做为心血管系统极其重要的神经介质之一的CGRP, 可通过扩张血管降低肾血管阻力(RVR)、增加肾血浆流量(RPF)和肾小球滤过率(GFR), 抑制系膜细胞收缩等作用, 对肾血流动力学有显著影响^[6]。结果表明:CGRP对ARF有明显的预防作用, 尤其是24h治疗组的各项肾功能指标均较实验组组差异有显著性(P < 0.01)。与文献[5]报道的结果相符。这些结果可提示CGRP对缺血性肾损伤有保护作用。