随着核能、核技术的广泛应用, 来自电离辐射的可能危害已经受到人们的普遍关注, 为此, 一系列的核辐射事故应急和医学救治的相关政策出台, 在核辐射事故应急和医学救治中准确迅速的确定每个人的受照剂量是事故应急、临床诊治、事故远期效应评价的重要环节。采用物理方法准确估算剂量有时非常困难, 存在着很大的局限性, 因此, 建立和发展广泛应用的生物剂量计就变得日益重要。辐射生物剂量计的研究已有近四十年的历史, 曾被筛选过的研究指标有近百种, 但是经实践检验证实有实用价值者却不过4~5种。目前较成熟的生物剂量计主要是染色体畸变分析法和淋巴细胞微核分析法, 但是在具体使用当中, 均有分析费时、适用剂量范围局限、不适于对受照群体进行快速、大规模检测等缺点。近年来出现的细胞基因突变分析技术克服了染色体畸变分析的不足, 成了辐射生物剂量学研究的新方向, 其中次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hprt)基因、T细胞受体(TCR)基因和血型糖蛋白A (GPA)基因等基因突变分析作为辐射生物剂量计得到了广泛研究, hprt基因和GPA基因位点突变频率的测量较为成熟, 国际上已经广泛应用于放射毒理、遗传毒理和环境医学领域, 而TCR基因突变测量则有待于进一步研究, 以期望在临床上获得更广泛的应用。笔者就体细胞TCR基因位点突变检测技术及其在电离辐射研究中的应用作一综述。
1 TCR基因的一般生物学特性TCR是外周CD4、CD8 T细胞表面的一种蛋白受体, 在对抗原的识别和由T细胞介导的免疫应答过程中起重要作用, TCR本身为异质性二聚体, 由α, β或γ, δ双链组成, 其两对等位基因(α, δ)和(β, γ)分别位于14号和7号染色体上, TCR基因的结构和重排与Ig基因有许多相似之处。在胚系中, 编码TCR多肽链的DNA是由几个分隔开的DNA片段组成, 在胸腺细胞中重排后, 形成编码一条完整多肽的基因。不同的TCR重组决定了T淋巴细胞对不同抗原的特异活性。一般认为, 在个体发育过程中, 如同Ig基因的重排和表达, TCRα和β链基因的重排和表达也有等位基因排斥现象[1](al-lelicexclusion), 如果在一条染色体上TCR基因的重排是有效的, 那么就可以抑制另一条染色体相应等位基因座的重排。当一条染色体上α链或β链基因座的重排、转录或翻译无效时, 则另一条染色体上相应α或β链相应的等位基因座开始发生重排。如果两条染色体上TCRα或β链基因重排都无效, 则未成熟的T细胞死亡。正是因为有这种等位基因排斥现象的存在, 所以每一对等位基因中只有一个能够表达。因此, 尽管TCR基因位于常染色体上, 却类似于女性中X染色体上的基因, 在功能活性上呈单倍性。发生在有活性的TCR基因的单个突变即可导致表现型TCR突变体的产生。TCR的α、β链只有在与另一蛋白质分子CD3结合形成完整的分子复合体TCRαβ/CD3以后才能被正常转运到细胞膜上。如果TCR的αβ中任何一个发生突变, 所造成的有缺陷的TCRαβ/CD3复合体就会因不能被正常转运到细胞表面而只能累积于细胞质中, 体外培养的TCR突变T细胞系的研究中已经证实了这一点[2]。基于这一点, 我们可以通过流式细胞分析技术检测CD3分子在细胞表面的存在情况来检测TCR基因的突变频率。不直接检测TCRαβ的主要原因是TCRαβ复合体的荧光标记抗体在流式细胞仪的测量过程中不能很好的区分正常细胞与突变细胞的荧光信号[3, 4]。
2 TCR基因突变分析技术与其他体细胞基因突变分析技术比较 2.1 HPRTHPRT, 即次黄嘌呤-磷酸核糖转移酶, 其基因位于X染色体长臂末端上, 体细胞中只有一个拷贝, 该基因是一个对电离辐射非常敏感的位点, 也是研究单基因突变的经典位点。该基因突变分析技术特别适用于评价急性照射和慢性小剂量照射的辐射危害程度。但是带有突变的HPRT基因是不稳定的[5]且突变的淋巴细胞在体内易被淘汰, 不能长期存在, 所以适用于受照射后两年内的估算[6]。一般认为, HPRT指标的适应分析剂量范围为1~2Gy[7]。
2.2 GPAGPA是人类种红细胞膜上的主要血型糖蛋白, 由一分别编码M和N两种类型蛋白的等位基因编码。电离辐射能引起MN杂合子表型转换, 用不同颜色的荧光标记的GPAM或GPA-N的单克隆抗体与红细胞结合, 经流式细胞仪检测分析就能确定其突变率。该基因突变分析技术可适用于受照已久远的剂量估算。1995年Jensen[8]等对切尔诺贝利核电站事故(10a后)中的120名受害者和营救人员进行GPA突变检测, 结果与其他方法所获得的结果一致。研究表明, GPA可作为一种终生生物剂量计反映个体一生的受照情况。近年来, GPA生物剂量计还用于肿瘤病人放射治疗后的剂量检测[9], 在评估个体接触有害理化因素致癌研究方面也展示了良好的应用前景[10-12]。但是由于RBC前体突变细胞发育成熟以后才能通过RBC将GPAMF反映出来, 所以GPA技术不能用于照后即测的研究。目前的研究表明GPA仅能用于约50% M/N杂合子人群的分析。
2.3 TCRTCR基因突变分析技术是新近建立起来的很有发展前途的生物剂量计[13], 目前的研究表明其剂量估算范围在0.2~4Gy。该技术与HPRT和GPA相比较有其独特的特点:① TCR分析技术测得的TCR突变频率较高(正常人平均为2.5 × 10-4), 要得到统计学上允许的最低频率所需要的样本仅需要1ml; ②TCR分析技术检测的淋巴细胞不需要固定, 所以分析时间较短, 仅约需要5h就可以完成; ③对于急性照射, Ishioka[14]等认为可以通过mitogen刺激淋巴细胞加速TCR蛋白的表达从而使突变在一周内得到表达, 从而使得TCR突变分析方法可以用于近期辐射暴露的剂量测定, 也可用于局部放疗的妇科肿瘤病人的剂量研究, 而且有较好的线形关系。对于长期慢性小剂量的受照情况目前尚无明确的结论。
3 TCR基因突变在生物剂量估算中的应用 3.1 原爆幸存者TCR基因位点突变Kyoizumi[13]用双色流式细胞技术测定了广岛203例原爆幸存者(其中78名近爆心照射, DS86大于或等于1.5Gy, 125名远爆心照射, DS86 < 0.005Gy)的T淋巴细胞TCR基因突变频率, 结果显示TCRMF在男性中明显高于女性, 但是与受照剂量没有明显的量效关系, 而且与远距离受照的低剂量对照组比较也无明显升高, 这说明TCRMF不是很稳定, 受照者体内的TCR突变细胞经过40多年的不断衰减已经基本恢复到正常水平。有研究表明TCRMF的半衰期约为3.2a。Taooka[15]等在测量了居住在Semipalatinsk核试验基地附近的96名居民(其中包括40名居住在Dolon和Sarzhal的高暴露人群和31名低暴露人群以及8名癌症患者)的外周血淋巴细胞TCRMF, 结果表明居住在Dolon和Sarzhal的高暴露人群的TCRMF明显高于低暴露组和对照组, 这一点与Kyoizumi报道过的TCRMF在原子弹爆炸幸存者中没有明显增加的结果相反, 作者分析可能是由于有内照射存在的结果。
3.2 事故受照者TCR基因位点突变Seyama[16]等用TCR生物剂量计检测了9名切尔诺贝利核电站事故受害者, 其结果与依据染色体畸变分析技术所得结果非常一致。
3.3 放疗病人的TCR基因位点突变Vershenya[17]等观察了53名经131I放射治疗的甲状腺癌患者, 他们在近5a内均接受过不同放射性活度的131I治疗, 结果表明试验组TCRMF与所给131I放射性活度呈显著的剂量效应线性关系, MF=1.86 ×10-4 +0.30 ×10-4D, P < 0.001, 其中D为给药的放射性活度。因研究的时候有的病人距离最后一次治疗5a之久, 说明TCRMF在受照后一定时间内仍然能够保持相对稳定。Taooka[15]观察了8名癌症患者(5a内接受过放射性治疗并曾经在核试验基地附近居住过)的TCRMF, 结果表明放疗患者的TCRMF明显高于高暴露组, 作者分析他们的TCR突变可以归因为放射性治疗和几十年前的事故照射的共同作用的结果。
3.4 职业受照者的TCR基因位点突变Saenko[18]等对在1986~1987年曾在切尔诺贝利事件后进行过清扫工作的人测量了TCRVF和GPAVF, 结果显示在受照剂量小于0.25Gy的人当中, TCRVF明显高于未受照射组, 作者认为作为近期受照的估算指标, TCR方法比GPA方法更有潜力。
3.5 评估癌患风险及检测免疫功能Vereshchagina[17]等比较了186名健康供者和46名未经治疗的甲状腺癌患者的外周血TCR位点突变频率后得出结论, TCR可以作为肿瘤高发的一个指标。Saenko[20]认为TCR位点和GPA位点都可以用在照射后长期的健康查体上, 因为突变细胞的个体可能代表患肿瘤的频率(风险)增大。Kyoizumi[21]等对共济失调性毛细血管扩张(AT)及范可尼氏贫血(FA)患者的研究表明, 这两类疾病都伴有DNA修复功能缺陷及T细胞免疫力低下, 患者的TCRMF很高, 对其进行的体外细胞克隆扩增的进一步研究显示, 这些突变确实来自TCR基因本身的变异。
4 TCR生物剂量计存在的问题TCR作为一种新的生物剂量计在近年来受到很多放射生物学者的关注, 但是需要注意的是作为一种血细胞基因突变分析技术, 一个不容忽视的问题是个体的基因自发突变, 自发突变是普遍存在的, 而且个体和个体之间还存在较大差异。这种差异是还随着个体年龄、精神状态、身体状况、生活方式(如是否吸烟、喝酒等)、生活环境(是否接触其他物理化学致突变因子)等的变化而变化, 因此在突变分析过程中必须考虑到这个因素。另外, 缺乏完整的TCR/CD3复合体的突变细胞在体内环境的自然选择过程中处于不利地位, 随着时间的推移而被逐渐淘汰。从这一点看来, TCR就不能作为一个终生的生物剂量计。而且到目前为止, TCR能否作为生物剂量来估算长期低剂量照射以后的剂量估算还不肯定, 有待于进一步的研究。
总之, 利用TCR突变频率来估算近期受照情况方便、简单、易操作; 但是由于它本身的限制, TCR并不太适合作为一个终生生物剂量计来估算几十年前受照个体的受照情况; 对于长期慢性小剂量受照情况, 到目前为止还没有明确的结论, 有待进一步的研究。
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