低剂量辐射(LDR)的抗肿瘤作用日益受到众多学者的关注, 研究表明低剂量辐射对荷人小细胞肺癌裸小鼠的肿瘤细胞有一定的促凋亡作用; 低剂量辐射可增强大剂量辐射促肿瘤细胞凋亡的作用^{[1, 2, 3]}。本研究旨在通过观察LDR对白血病小鼠骨髓肿瘤细胞凋亡的影响, 探索全身低剂量辐射对白血病的辅助治疗价值。

1 材料和方法 1.1 动物模型的建立

小鼠粒单白血病细胞系WEHI - 3由协和医科大学细胞中心提供, 将体外培养扩增的细胞悬液0.5 ml (含WEHI- 3细胞1 ×10⁶), 尾静脉注射接种于8周龄成年BALB /c小鼠(编号:鲁动质字200001002号)体内。接种后密切观察小鼠生活习性的变化, 于第15天、20天、25天和28天经尾静脉取外周血进行白细胞计数及分类, 血涂片瑞氏染色OLYMPUSU - SPT光学显微镜观察。

1.2 分组及处理方法

将60只成功建立的粒单白血病模型小鼠, 对半分为实验组和对照组。对照组小鼠不予LDR, 实验组小鼠同时给予总剂量75mGy的LDR, 密切观察小鼠生活习性的变化, 于LDR后1d、2d、3d、5d和10d分别处死6只实验组及相应数量的对照组小鼠, 取其骨髓并行骨髓涂片。照射使用WDVE - 6 /100型直线加速器, 靶皮距100cm, 剂量率12.5 mGy / min, 总剂量75mGy, 将小鼠置于加速器照射野内一次性全身照射。

1.3 骨髓涂片的荧光显微镜观察

处死小鼠取其骨髓涂片, 使用碧云天Hoechst凋亡染色试剂盒(产品编号C0003, 生产日期2004年9月), 具体步骤按其说明进行。德国产LEICA DMIREZ型荧光相差倒置显微镜观察, 计数200个白血病细胞, 计算凋亡细胞百分率。

1.4 骨髓标本的电镜观察

处死小鼠取其骨髓, 用3%戊二醛固定2h, 1%的锇酸后固定1h, 常规梯度脱水, Epon812环氧树脂包埋, 超薄切片, 经醋酸双氧铀、柠檬酸铅染色后封片, 日本产H - 7500透射电镜观察。

1.5 统计方法

各组计量资料数据以x ±s表示, 两两比较采用t检验。

2 结果 2.1 动物模型的观察

接种WEHI - 3细胞后BALB /c小鼠外周血白细胞计数于15d开始升高, 出现未成熟粒、单核细胞(见表 1)。

接种后20d ~ 28d发病, 外周血中可以见到粒单白血病细胞, 光镜下胞体较大, 形态不规则, 核染色质纤网状, 可见凹陷折叠, 胞浆天蓝色, 可见紫红色嗜天青颗粒。小鼠发病后精神萎靡, 目光暗淡, 步态不稳, 行动迟缓, 食量减少, 腹部日渐膨隆。上述检测显示白血病模型已成功建立。白血病小鼠LDR后2天内活力明显增强, 进食增多, 活动量增加。

2.2 荧光显微镜观察

荧光显微镜下可见小鼠正常骨髓细胞核发出淡蓝色的荧光, 发生凋亡的细胞核呈致密浓染, 或呈碎块状致密浓染, 形状不规则(图 1)。小鼠骨髓白血病细胞凋亡百分率与对照组比较见表 2。由表 2可见LDR后第2天、3天小鼠骨髓白血病细胞凋亡百分率最高, 5d和10d次之, 与对照组比较差异显著(P均 < 0.05), 对照组间凋亡细胞百分率无明显差异(P >0.05)。

2.3 电镜观察

电镜下实验组和对照组骨髓中均可见胞核形状极不规则的白血病细胞, 实验组电镜下多见发生凋亡的白血病细胞, 可见核染色质边集现象和凋亡小体(图 2), 对照组少见。

3 讨论

众所周知, 近20年来国内外学者的研究证明LDR能使机体的某些生物功能增强, 即所谓的LDR对生物生命活动的兴奋效应^[5]。LDR兴奋效应涉及许多生物学现象, 例如生长加速、体重增加、寿命延长、生育增多、修复功能上调、防卫机能增强、适应能力升高等。临床研究也发现LDR可导致患者机体抗肿瘤免疫反应增强, 可减少肿瘤的生长、扩散及转移^{[6, 7]}。如坂本澄彦1986年应用于临床治疗恶性淋巴瘤, 全身吸收剂量为0.1 ~ 0.15 Gy, 隔日照射1次。经5周全身照射, 淋巴瘤局部或大块状的情况还并用大剂量直接照射。结果80%患者癌灶消失, 20%局部消失, 追踪3年, 无复发。其疗效是由于提高了淋巴细胞自发增殖力, 增加外周血的CD +细胞, 抗氧化酶活力、吞噬细胞溶解细胞活力, NK细胞活力, IL - 2分泌和氧化氮产物等的增强(或增多), 增加了DNA修复能力, 降低电离辐射诱发自由基等, 从而显著的改善放疗或化疗肿瘤患者的预后^[5]。在其他的临床研究中, 低剂量全身照射用于低度恶性淋巴瘤和慢性淋巴细胞性白血病的治疗, 分割剂量为0.1 ~ 0.25 Gy, 每周5次, 总剂量为1.5 ~ 2.0 Gy, 可诱导多数患者长期缓解, 未观察到严重的副作用, 疗效可与化疗相媲美^[8]。这些初步的临床研究提示全身LDR有希望成为白血病、淋巴瘤及真性红细胞增多症等全身性疾患治疗的新途径。

近年来, 吉林大学谭业辉等人^[9]的动物实验证实LDR具有抗淋巴细胞白血病的作用, 可使荷瘤小鼠白血病细胞生长受抑制, 延缓白血病小鼠病情进展, 生存期延长。本实验研究通过荧光显微观察发现75mGy的LDR可以有效的提高小鼠骨髓白血病细胞凋亡率, 其作用机制明显不同于大剂量射线治疗对肿瘤细胞的杀伤, 通过电镜亚细胞结构的观察也进一步证明了这一点, 可能与LDR增加小鼠免疫兴奋效应, 促进某些细胞因子分泌有关^[10]。然而, LDR抗肿瘤作用的机制是一个相当复杂的问题, 其表现涉及复杂的细胞间反应和天然及获得免疫间的相互关系^[10-12], 全身LDR能否真正用于临床治疗白血病, 还有大量的问题亟待研究。