国外学者从不同角度研究证明, 低剂量辐射可刺激动物的生长、发育, 还可增强动物和人体的免疫功能, 降低肿瘤的发生率称为兴奋性效应; 近年又有证明低剂量辐射预先处理细胞后可产生对相继较大剂量辐射诱发遗传物质损伤的抗性, 称为适应性反应。许多理化因素都有这种作用, 例如噪声的习服(condition)可以减轻噪声对耳蜗的影响就是其中的一种。国内外也有动物实验证明:低剂量辐射对大鼠的免疫功能具有刺激作用, 可增强大鼠免疫功能, 其免疫增强的中心环节是T细胞激活[1~3]。笔者从细胞角度和分子角度探讨, 低剂量照射对大鼠免疫功能影响免疫学机理的研究。
1 材料与方法 1.1 动物Waister大鼠(购于山东大学动物中心), 体重180 ~220g, 雄性32只, 随机分为四组, 每组动物8只。低剂量组: 3组, 50mG y、100mG y、500mG y。对照组:1组。
1.2 照射条件采用西门子PR IUS医用电子直线加速器, 照射野为40 cm ×40cm, 源皮距205cm, 剂量率100cG y/m in, 等中心剂量分别为0, 8, 19, 100cG y。
1.3 观察指标于照射后2、8、15d抽大鼠颈静脉全血2m l, 肝素抗凝, 检测其功能。
1.3.1 免疫功能检测NK细胞活性测定, 全淋巴细胞、CD4+、CD 8+细胞, 采用流式细胞法。
1.3.2 细胞因子的检测采用免疫组化的方法, 主要步骤①切片脱腊; ②3% H 2O2甲醇30m in; ③ 1:5正常羊血清30m in; ④兔抗TN F-а、IL-2单抗(1:1000), 4℃过夜; ⑤山羊抗兔IgG -Bio tin (1:200), 40m in, S trepav idin-Bio tin-HRP 40m in; ⑥ DAB-H 2O 2显色; ⑦苏木苏复染核。抗体和ABC免疫组织化学试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供。主要检测白介素(IL-2)、肿瘤坏死因子(TNF-α)在照射后的变化。
1.3.3 脏器指数15d后处死大鼠, 取其脾脏和胸腺, 称重并计算脏器指数。脏器指数=某脏器重量(g)体/重(g)× 100%
1.4 统计学处理建立计算机数据库, 医学统计学分析方法(SPSS)。
2 实验结果 2.1 照射后大鼠外周血细胞中淋巴细胞亚群的改变(表 1)
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表 1 低剂量辐射对大鼠淋巴细胞亚群的影响(p ±s, p %) |
从表 1可见, 50mG y和100mG y照射后24hCD4+、CD 8+细胞的功能改变差异有显著性(P < 0.05);0.5Gy照射对两种细胞都产生不同的抑制作用(P < 0.01)。
2.2 低剂量对NK细胞活性的影响在100mG y照射第一天后, NK细胞活性明显升高, 和对照组比较差异有显著性(P < 0.05), 其他组未见现显著性差异(P >0.05), 100mG y照射组NK细胞变化差异有显著性(P < 0.01)。随着照后时间的延长, 大鼠NK活性逐渐下降, 见表 2。
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表 2 低剂量照射对NK细胞活性的影响 |
在所有的组中, 低剂量照射后淋巴细胞总数都要上升, 但是在100mGy照射后上升较明显(P < 0.01), 但在500mG y照射后下降明显(P < 0.01), 见表 3。
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表 3 低剂量照射对淋巴细胞总数的影响(p ±sp, ×109/L) |
表 4中显示:照射后从第1天到第21天, 各组的大鼠的体重都没有受到明显的抑制, 见表 4。
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表 4 低剂量照射后大鼠体重的变化(p±sp, g) |
在50mGy和100mG y照射后脾脏和胸腺的相对指数升高, 但差异无显著性, 在500mG y照射后指数下降, 表明照射后有抑制作用, 但是无显著性差异, 见表 5。
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表 5 低剂量照射对大鼠脏器指数的影响(p±sp, mg/g) |
镜下可见TN F-а, IL -2表达的阳性细胞, 其胞浆为棕黄色着色, 背景为无色。大鼠经100mG y照射后24h, 外周血中TNF含量显著升高, 说明在该剂量下, 单核-巨噬细胞系统受到激活, 促使TNF-α分泌增加, 在其余各剂量组中则没有100mG y剂量组变化明显, 见图 1~2。
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图 1 照射后脾脏组织TN F-а的变化(苏木素染色) |
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图 2 照射后脾脏组织IL-2的变化(苏木素染色) |
许多学者认为, 放射敏感性越高的细胞群[4], 发生辐射刺激作用的剂量越低, CD4+细胞是辐射最敏感的细胞亚群, 致使在50mG y照后表现出最大的刺激效应, CD 8+细胞在100mGy照射后表现出与CD4+类似的刺激效应, 可能是由于CD4+细胞放射敏感性高于CD 8+细胞造成的, 因此低剂量辐射能在一定程度上调整大鼠免疫T细胞比例, 改善免疫功能, 而500mGy对各亚群有抑制作用。同时低剂量辐射能增强NK细胞的活性, 低剂量照射24h后所有的组NK细胞活性都要上升, 100mG y照射24h后NK细胞活性明显升高, 和对照组比较差异有显著性(P < 0.01), 但随着时间的推移, 活性开始明显下降, 回到水平[5~7], 500mG y照射后未产生明显影响。NK细胞表现为非特异性杀伤效应, 识别不受M HC限制, 具有广谱的肿瘤杀伤效应, 是机体抗肿瘤的第一道防线, NK细胞对瘤细胞的的杀伤效应与其释放的介质有关, 除分泌穿孔素、颗粒酶溶解肿瘤细胞以外, 还可释放IFN-r、TN F-α和GM-CSF等细胞因子, 增强杀伤肿瘤细胞的能力。在50mG y和100mG y照后对全淋巴细胞刺激效果表现增强, 尤其在100mG y照后表现出最大的刺激效应, 而500mG y对其有抑制作用。
实验结果表明低剂量照射后胞浆着色变化不一, 说明低剂量照射使细胞因子IL-2、TNF-α分泌受激程度不一样。100mG y照射后着色最深说明了此剂量照射最能促使细胞因子分泌, 也最能增强生物活性和细胞免疫应答, 从而提高机体的抗肿瘤和抗感染的能力。该理论基础可能是低剂量辐射照射能促进T细胞激活与增殖, 激活Th细胞, 发生连锁反应, Th细胞分泌IL-2、TN F-α增多, 同时IL-2、TN F-α又是维持机体免疫功能的关键细胞因子, 它能促进T细胞存活和增殖, 又可促进抗肿瘤细胞免疫效应细胞NK、特异性CTL杀伤活性。
电离辐射能抑制动物体重, 剂量越高, 这种抑制作用越大, 在各组低剂量照射组中, 体重没有明显差异。脏器指数在一定程度上反映该脏器的功能指标, 50mGy和100mG y照射后, 大鼠脾脏指数呈升高的趋势, 有一定的代偿作用, 但没有显著性差异, 说明低剂量辐射对其影响不大。
以上结果和分析说明, 电离辐射小于500mG y的低剂量辐射对大鼠的免疫功能具有一定的刺激作用, 尤其是100mG y的低剂量辐射对大鼠的免疫功能刺激作用最为明显, 而且在照射24h后淋巴细胞数目以及活性增强明显, 提示低剂量电离辐射预照射诱导了大鼠的适应性反应和兴奋性效应, 可能有提高常规放射治疗疗效和减轻副作用的功效。我们的动物实验结果支持低剂量照射和放疗的联合应用, 为临床低剂量照射配合放疗、化疗工作的开展提供理论依据。
4 结论以上结果和分析说明, 电离辐射小于500mG y的低剂量辐射对大鼠的免疫功能具有一定的刺激作用, 表现在CD4+细胞、CD 8 +细胞亚群增加, NK细胞活性明显增高、单核-巨噬细胞系统受到激活, 促使IL-2、TN F-α分泌增加, 这些指标的升高, 使机体的免疫功能增强, 提示低剂量电离辐射预照射可能有提高常规放射治疗疗效和减轻副作用的功效。
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