钠/碘共同转运体(sodium/iodidesymporter, NIS)是一种跨膜糖蛋白, 主要存在于甲状腺滤泡细胞基底膜上, 是甲状腺细胞摄取碘的分子基础。随着对hNIS基因的克隆成功, 使人们对包括自身免疫性甲状腺疾病及先天性甲状腺功能减低在内的多种甲状腺疾病的分子机制有了更深入的研究, 而其转染肿瘤细胞介导的放射性治疗, 可在非甲状腺肿瘤与不摄碘的甲状腺癌实现放射性碘治疗, 从而为众多难治性肿瘤开辟了全新的治疗途径, 具有广阔的临床应用前景。

1 NIS基因的克隆及其二级结构

DaiG等^[1]于1996年在《Nature》上首次发表了对大鼠钠/碘同向转运体(rNIS)基因的克隆结果。rNIS长度为2 839个碱基对, 其开放阅读框架为1854个核苷酸, 转录体大小为2.8kb, 编码一个长约618氨基酸的蛋白质, 分子量为65.2ku。同年, Smanik等^[2]利用rNIScDNA引物, 经逆转录一聚合酶链反应(RT-PCR)并筛查人甲状腺cDNA文库, 获得了hNIScDNA克隆。hNIS基因位于19p12-13.2上, 其开放阅读框架为1929个核苷酸, 编码区由15个外显子和14个内含子组成, 转录体大小为3.7kb, 编码一个长约643氨基酸的蛋白质, 包括13个跨膜区, 分子量为68.7kDa, 与rNIS具有84%的同源性。三个带电氨基酸残基(Asp16, G1u79, Arg208)分别位于Ⅰ、Ⅱ、Ⅵ跨膜区, 被认为与介导碘摄取有关。1998年Levy等^[3]又证实了位于跨膜区IX的几个含羟基的氨基酸残基(Ser353, Thr354, Ser356及Thr357)对其功能至关重要, 其基因突变将会引起摄碘功能丧失。

2 NIS的功能及其分布 2.1 NIS的电生理学特性

I^-在NIS的介导下, 能逆电化学梯度被摄取。显示出甲状腺具有强大的聚碘能力, 其内碘的浓度是血浆碘浓度的20~40倍。Eskudari等^[4]通过对表达NIS的非洲蟾蛛卵母细胞进行电生理、示踪摄取等研究结果显示:NIS活性依赖于Na⁺(Na⁺> > Li⁺>> H⁺)。在Na⁺的驱动下, Na⁺与阴离子以2:1同向转运。其中I^-、SeCN^-、ClO₃^-和NO₃^-能稳定转运, I0₄^-、BF₄^-和ReO₄^-具有部分抑制I^-转运而同时能被NIS^-定程度转运; Cl0₄^-可与NIS结合完全抑制I^-转运, 本身不被NIS转运; SCN^-也竞争性抑制I^-转运。但SCN^-可被NIS转运。

2.2 NIS的表达分布

在正常甲状腺组织内hNIS的表达呈异质性, 仅在少数紧靠毛细血管的滤泡细胞基底细胞膜上有hNIS的表达^{[5, 6]}。在多结节甲状腺肿组织中, NIS的表达亦呈异质性, 但较正常组织表达增强^[6]。在Graves'病(GD)的甲状腺组织中, 大量的滤泡细胞有hNIS的表达^{[6, 7]}。Callou等^[6]研究了自身免疫性甲状腺炎甲状腺组织中hNIS的表达情况, 发现NIS蛋白与正常甲状腺组织相似。在甲状腺癌组织中NIS的表达下降, 而且分化良好的甲状腺癌组织较分化差的癌组织NIS表达水平高^[6]。间变性甲癌和Hurthle细胞癌中均无NIS蛋白表达^{[7, 8]}。亦有研究证明NIS的表达水平与甲癌组织及癌转移灶组织的碘摄取能力直接相关, 所以甲癌组织中NIS的表达水平在临床上可用来预测放射性碘治疗的疗效, 选择放射性碘治疗的适应症^[6]。此外, 发现人体许多甲状腺外组织均不同程度的表达NIS, 如唾液腺、胃粘膜、乳腺、前列腺、卵巢、肾上腺、胸腺以及肺等组织, 但与甲状腺组织相比, 甲状腺外组织NIS表达水平相对较低。

3 NIS的基因调控

NIS基因调控的具体方式尚不清楚。目前仅知, hNIS基因转录起始点位于第375位核苷酸的ATG位点^[9]。曾有报道, 甲状腺转录因子-1(TTF-1)和(或) Pax8可以调节编码甲状腺球蛋白(Tg)、甲状腺过氧化物酶(TPO)和促甲状腺素受体(TSHR)的基因。Endo等^[10]通过电泳动力学、I型DNase酶印迹法及共转染分析, 发现TTF-1参与NIS的表达机制, 其反义链的5'-CAAG-3'片段含有TTF-1的结合区域。Ryu等^[9]发现甲状腺特异性转录因子TTF-1序列中包含有活化蛋白AP -1、AP-2、刺激蛋白SP-1和CAMP反应性结合蛋白的序列, 提示TTF-1可能与hNIS的转录有关。Ohna等^[11]又发现, 位于NIS基因5'-端2 264-2 495核苷酸之间的一个启动子NUE, 是调节NIS的首要部件。当与其自身或异种性启动子融合后, NUE就能经cAMP依赖性方式刺激NIS转录。而甲状腺特异性转录因子Pax8正是通过激活NUE, 活化cAMP反应元件序列来调控NIS合成的。最近, Joba等^[8]应用定量RTPCR方法证实TTF-1和Pax-8基因表达水平与GD组织中NISmRNA表达明显相关。

4 NIS的调节 4.1 促甲状腺素(TSH)

甲状腺的功能和碘的摄取依靠TSH调控, TSH是上调NIS基因表达的主要因素。这种上调作用可能是通过cAMP信号传导途径实现的, 即TSH与甲状腺细胞上的受体结合后, 可以引起cAMP途径的级联反应, 最终可使甲状腺特异性转录因子TTF-1, TTF-2及Pax-8磷酸化, 磷酸化的TTF-l, TTF-2及Pax-8基因表达增加、转录调节活性增高^[12]。而且有研究表明, TSH能剂量依赖性地刺激FRTL- 5细胞和原代培养的甲状腺细胞表达NIS^[13]。Caillou等^[6]发现甲状腺癌组织中TSH受体阳性的细胞数减少, 从而导致TSH的上调作用减弱, 使NIS表达减少, 组织摄碘能力下降。

4.2 细胞因子

生长因子(TGF)是重要的甲状腺生物调节剂。Pekary等^[14]发现TGF-β选择性抑制FRTL-5细胞中蛋白激酶A介导的碘摄取和PKC介导的DNA合成, 这一作用是通过减少NISmRNA实现的。Ajjan等^[15]发现IL-1α、IFN-γ、TNF-α对NIS基因表达均有下调作用, 三者浓度在1 OOOU/ mL时, 分别使TSH诱导的NIS基因表达下调65%~80%, 40%~65%, 65%~70%。Pekary等^[16]也证实了TNF对NIS基因表达有下调作用。最近, Spitzweg等^[17]发现IL-1β和IL -6亦可减少FRTL-5细胞中NISmRNA的表达, 同时IL-1β也可抑制细胞的聚碘功能。临床上的自身免疫性甲状腺功能减退症, 尤其是桥本甲状腺炎的病程早期的甲状腺摄碘功能下降, 可能与某些细胞因子抑制组织中NIS基因表达有关。

4.3 碘的调节作用

1948年, Wolff和Chaikoff观察到了"急性Wolff-Chaikoff效应"。随后, Uyttersprot等^[18]在给患甲减的狗服用碘化钾48小时后, 证实了TPOmRNA和NISmRNA表达减少, 而TG和TSH受体mRNA表达无变化; Eng等^[19]给大鼠一次性喂入大量碘造成急性高碘状态, 同时另一组大鼠给以连续少量碘摄入造成慢性高碘状态, 观察在两种状态下NISmRNA及蛋白质水平均有下降, 认为这可能与碘诱导的甲状腺功能减退症的发生有关。推测高碘对NIS基因表达的抑制作用可能部分是在转录水平上实现的。Spitzweg等^[17]也发现KI可抑制FRTL-5细胞的NISmRNA的表达和摄碘活性。另外, 低碘及长期慢性高碘状态对NIS表达的影响目前还不清楚。

4.4 甲状腺球蛋白(Tg)

Suzuki等^[20]进行体内与体外实验证明了生理浓度的Tg可抑制TSH诱导的NIS启动子的活性, 从而降低NISmRNA和蛋白质的表达和细胞的摄碘能力。Kohn等^[21]研究FRTL-5细胞时发现, Tg是NISmRNA的潜在抑制剂, 与TSH促进Tg, TPO, TSHR基因的作用正好相反。Tg对NIS基因表达的抑制作用可作为一种负反馈机制, 与TSH介导的NIS基因表达增强作用之间形成一种相互制约的关系, 以维持内环境的相对稳定。

4.5 维甲酸(RA)的调节

近年来, 利用RA诱导肿瘤分化的特性治疗甲状腺癌的研究已经有所进展。Schmutzler等^[22]证实了RA能上调体外培养的人滤泡性甲状腺癌细胞系的NISmRNA水平, 同时降低正常FRTL-5细胞的NIS表达及抑制碘的摄取。Simon等^[23]用RA (5mg· kg^-1· d^-1, 共5周)对20例晚期甲状腺癌患者进行治疗, 结果发现有50%的肿块再度摄碘。根据维甲酸对NISmRNA表达的上调作用, 临床上可通过给某些对放射性碘治疗不敏感的患者服用维甲酸, 使其恢复对放疗的敏感性, 而获得进一步治疗的机会。

4.6 其他因素的调节

Spitzweg等^[17]发现地塞米松和T3能使FRTL-5细胞NISmRNA含量减少70%, MMI、PTU、过氯酸盐及KI均能抑制NISmRNA达50%。而胰岛素则促进TSH或cAMP类似物8-bromo-cAMP对碘摄取的刺激作用。泌乳素能通过增加鼠乳腺组织中NIS的表达, 促进碘在乳汁中的聚集。胆酸(如鹅去氧胆酸)也能抑制基础和TSH或8-bromocAMP或二萜衍生物(forskolin)诱导的碘摄取。近来, Furlanetto等^[24]证实雌二醇可下调FRTL-5细胞NISmRNA的表达, 但对细胞增殖有刺激作用, 并认为女性患者甲状腺肿发病率较高可能与此有关。

5 NIS的基因突变

目前认为NIS基因的突变可能与先天性甲状腺功能减退症的发生有关。1997年, Fujiwara等^[25]报道了第一例由NIS基因突变引起的先天性甲状腺功能减退症, 以后陆续又有许多学者在先天性甲减病人中发现了NIS基因突变的不同位点。目前已明确的NIS基因突变位点有7个, 分别是T₃₅₄P、Q₂₆₇E、Y₅₃₁X、C₂₇₂X、G₉₃R、G₅₄₃E、G₃₉₅R。G₉₃R、Q₂₆₇E和Y₅₃₁X见于杂合子, 患者临床表现正常; C₂₇₂X、G₅₄₃E、G₃₉₅R见于纯合子型突变。T₃₅₄P突变类型可为纯合子或者是与G₉₃R突变共存, 日本人中NIS基因突变的类型主要是T₃₅₄P。体外实验证实, 上述类型的基因突变均可引起NIS蛋白生物学活性丧失, 从而导致甲状腺细胞碘转运能力的丧失。目前认为, NIS基因突变所引起的碘转运功能障碍, 是由于突变引起NIS蛋白质的构型发生改变, 导致碘与NIS蛋白结合障碍。

6 NIS的临床意义 6.1 NIS与甲状腺疾病

随着NIS研究的不断深入, 人们发现某些甲状腺疾病与NIS有着密切的联系。在一些甲状腺自身免疫疾病的血清中发现了NIS抗体的存在, 尤其使Graves病的患者, 阳性率可高达84%;桥本氏甲状腺炎(HT)和自身免疫性甲状腺功能低下, 抗体阳性率分别为20.8%和24%。研究发现, GD及HT患者血清中的IgG可与NIS膜外多处抗原决定簇结合(其中包括ExMD8、11、12、13)。Ajjan等^[26]在中国大鼠卵细胞(CHO)中成功表达了人NIS蛋白, 用GD患者血清可明显抑制CHO对碘的摄取。Endo等^[27]从4份与重组NIS有强烈反应的HT患者血清中提取IgG, 发现其能抑制甲状腺14%~ 60%的摄碘活性。以上结果均表明, NIS作为一种自身抗原在自身免疫性甲状腺疾病的发病中起着重要作用。

在甲状腺先天性疾病中, 经过多年的研究, 人们认识到NIS基因突变导致先天性N₁S蛋白功能异常是一个重要的原因。基因突变可发生在多个位置, 如T₃₅₄P、C₂₇₂X、G₉₃R、G₅₄₃E、G₃₉₅R型突变等等。其中T₃₅₄P最为常见。Pohlenz等^[28]人报道了一位36岁的巴西男性甲低患者, 在其NIS基因的第272个密码子处发生突变(TGCTGA), 使NIS肽链合成提前终止。将突变基因导入COS-7细胞表达NIS蛋白, 细胞不表现出I^-摄取活性。Matsuda等^[29]报道一位近亲婚生的男性巨大甲状腺肿患者, 其NIScDNa⁺1060位的核苷酸发生错义突变, 由胞嘧啶取代了腺嘌呤。从而使其翻译产物中354位的苏氨酸变成了脯氨酸。

在甲状腺肿瘤中, 腺瘤、分化癌均表现为不同程度的NIS表达下降, 而在未分化癌中几乎没有NIS表达, 因而其摄碘明显减少或根本不摄碘。可是近年来, 应用RT-PCR技术, 观察到分化型甲状腺癌(DTC)的NISmRNA阳性率约为22%~ 96%, 说明NISmRNA水平, 不能反映NIS蛋白的表达和质膜的结合位。而质膜NIS的位点和表达, 对主动性转运I-是至关重要的。Dohan等^[30]分析了57例DTC患者的样本, 70%的DTC样本有过多NIS表达, 免疫组化显示大多数肿瘤样本的NIS带在胞浆内。Saito等^[31]同时用Northernblot和Immunoblot分析4例甲状腺乳头状癌(PTC)患者的样本, 发现肿瘤组织有大量的NIS带。NIS带出现在整个细胞中, 可以推断大多数DTCI-摄取的减少, 是由于NIS位点的改变。

6.2 NIS与¹³¹I治疗

临床上, 人们已经应用放射性¹³¹I治疗甲状腺功能亢进及分化较好的甲状腺癌。但未分化癌及20%左右的分化癌及其转移灶因无NIS表达而不具有摄碘功能。这就给甲状腺癌的同位素治疗带来了很大困难。Schmutzler等^[32]观察到维甲酸可增加人甲状腺滤泡癌细胞NIS的表达。临床资料显示, 维甲酸治疗分别使不摄碘的甲状腺癌患者9例中的4例、12例中的5例重新获得了摄碘功能, 并有效地进行了放射性碘治疗。Venkataruman等^[33]使用脱甲基化药物:5-氮胞苷和7-钠丁酸盐, 诱导NISmRNA, 可部分恢复摄I^-活性。Zarnegar等^[34]用曲古抑菌素A, 观察三种甲状腺癌细胞株131I的摄取, 发现NISmRNA转录增强, PDSmRNA转录减少, I^-摄取增强。促进NIS的表达及活性, 使甲状腺癌细胞摄碘增加, 将有助于减少辐射剂量, 提高¹³¹I的疗效, 并可使原来不具摄碘功能的甲状腺癌原发灶及转移灶得到治疗。

将NIS基因转染其他肿瘤细胞, 使其具有摄碘功能, 为肿瘤的治疗开辟了一条新路径。Boland等^[35]用腺病毒作载体, 将rNIS基因导入肿瘤细胞, 发现感染此病毒的瘤细胞的¹²⁵I摄取量比没感染的瘤细胞高125225倍。Mandell等^[36]使用逆转录病毒载体将rNIS基因转入黑色素瘤、卵巢肿瘤和肝癌细胞, 有NIS的功能性显示, 表现I^-摄取增多。将转染后的人黑素瘤细胞注射到裸鼠后肢腹侧, ¹³¹I的治疗后, 有56%~69%的肿瘤细胞被杀死。另外, 使用含有NIS基因的组织特异性启动子, 提供了针对NIS的靶向性治疗。Spitzweg等^[37]在体外构建了以PSA (前列腺特异性抗原)为启动子指导NIS基因表达的前列腺癌细胞系(LNCaP), 将其接种于无胸腺裸鼠皮下, 建立了表达NIS基因的前列腺肿瘤细胞模型, I^-摄取增加了25%~ 30%。一次性给予3 mCi的¹³¹I可使瘤体积缩小90%。因此, 可以推断NIS基因转染技术, 将对甲状腺和甲状腺外肿瘤细胞的治疗是非常有效的。