随着天然药物的开发, 越来越多的研究转向丰富的海藻资源。海藻中含丰富的多糖, 它们具有抗辐射、抗肿瘤、抗感染、抗凝血、延缓衰老等生理活性^{[1, 2]}。为寻找天然低毒高效的抗辐射免疫调节剂, 本研究探讨了粗江蓠多糖对¹³¹I辐射损伤大鼠胸腺细胞和脾细胞的影响。粗江蓠(Gracilaria Gigas Harvey)是多年生的大型红藻, 属于红藻门, 真红藻纲, 杉藻目, 江蓠科, 江蓠属, 是我国广东、浙江、台湾沿海藻类养殖品种之一。目前, 粗江蓠主要用于工业生产琼胶, 对生理调节作用的研究报道较少, 为开发粗江蓠的应用价值, 笔者探讨了粗江蓠多糖对辐射损伤大鼠胸腺和脾细胞增殖的影响。

1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 实验动物

SD大鼠, 8~10周龄, 广东医学院动物中心提供。

1.1.2 材料与试剂

粗江蓠(购于湛江市新台兴海洋生物制品有限公司), RPMI 1640培养基(美国Gibco公司), 小牛血清(杭州四季青公司), ¹³¹I(广东医学院附属医院核医学科惠赠), ConA和LPS(美国Sigma公司产品), ³H-TdR(中科院上海原子核研究所)。

1.1.3 仪器

SW-CJ-1D型净化工作台(苏州净化设备厂), TC2323型CO₂培养箱(美国SHELLAB公司), 台式离心机(上海安亭科学仪器厂), ZT-Ⅱ型多头细胞收集器(浙江电子医疗仪器厂), LS-6000SC型标准架液体闪烁系统(美国BECKMAN公司)。

1.2 方法 1.2.1 多糖的提取

粗江蓠多糖(GHPS)为本室提取:粗江蓠洗净、干燥粉碎, 经热水浸提, 乙醇沉淀, Sevag法去蛋白, 乙醇和有机溶剂多次洗涤, 真空干燥为灰白色粉末。用生理盐水配制成10%的GHPS原液, 6.895千帕10 min高压消毒。用RPMI 1640培养液配制成终浓度为1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 mg/ml多糖溶液。

1.2.2 单细胞悬液的制备

将大鼠颈椎脱位处死后, 置75 %乙醇中浸泡5 min, 无菌取出脾脏和胸腺置于平皿中, 去掉结缔组织, 分别用生理盐水清洗3次。加入2 ml RPMI 1640培养液, 用剪刀分别将脾和胸腺剪成1 mm³碎块后, 用毛玻片轻柔研磨组织碎片, 经8层纱布过滤制成单细胞悬液, 用Hanks液离心洗涤后, 将细胞悬浮于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中。经台盼兰染色, 计数活细胞在95 %以上, 调整细胞数至5 ×10⁷ ml。

1.2.3 胸腺细胞的自发增殖反应

取96孔培养板, 每孔加入5×10⁷ ml胸腺细胞悬液100μl, 正常对照组(A组)每孔加80 μl RPMI1640培养液。照射组(B组)每孔加50 μl RPMI 1640培养液和30 μl ¹³¹I(3.7 ×10⁸Bq)。GHPS加照射组(C~H组)每孔加1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 mg/ml的GHPS溶液50 μl和30 μl ¹³¹I (3.7×10⁸ Bq)。各组均为三复孔。置37 ℃, 5% CO₂培养箱中培养66 h后, 每孔加入30 μl³H-TdR(18.5 kBq/ml), 继续培养6 h, 用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上, 60 ℃烘干, 放在玻璃闪烁杯中, 加10 ml闪烁液, 用标准架液体闪烁系统测每分钟计数(Count per minute, cpm)。

1.2.4 脾细胞的增殖反应

取96孔培养板, 每孔加入5 ×10⁷ ml脾细胞悬液100 μl。正常对照组(A组)每孔加80 μl RPMI 1640培养液和50 μl ConA (10 μg/ml)或LPS(40 μg/ml)应用液。照射组(B组)每孔加50 μl培养液、50 μl ConA (10 μg/ml)或LPS (40 μg/ml)应用液和30μl ¹³¹I。GHPS加照射组(C~H组)每孔加入1.0, 2.0, 3.0, 4.0, 5.0, 6.0 mg/ml的GHPS溶液50μl和Con A (10μg/ml)或LPS (40μg/ml)溶液50 μl, 再加入30 μl ¹³¹I(3.7 × 10⁸ Bq)。各组均为三复孔。置37 ℃, 5% CO₂培养箱中培养66 h后, 每孔加30μl³H-TdR(18.5 kBq/ml), 继续培养6 h, 用多头细胞收集器收集细胞于玻璃纤维滤纸上, 60 ℃烘干, 放在玻璃闪烁杯中, 加10 ml闪烁液, 用标准架液体闪烁系统测cpm值。

1.2.5 统计学处理

用SAS8.0软件进行单因素方差分析, 组间差异的显著性用q检验, 多个样本均数与对照组样本均数之间的比较用t检验。

2 结果 2.1 GHPS对辐射损伤大鼠胸腺细胞的影响

从表 1看出B组胸腺细胞接受3.7 ×10⁸ Bq的¹³¹I的照射后, cpm值显著低于A组(P < 0.01)。C组自发增殖反应高于B组, 但无统计学意义(P >0.05), D~H组胸腺细胞自发增殖反应明显高于B组(P < 0.01)。C~E组随GHPS浓度的增加, cpm值也相应增加; F~H组cpm值随GHPS浓度的升高而降低。

2.2 GHPS对辐射损伤大鼠脾细胞的影响

从表 2可以看出B组脾细胞对Con A和LPS刺激的脾细胞增殖反应明显低于A组(P < 0.01)。C~H组脾细胞对Con A和LPS刺激的增殖反应明显高于B组(P < 0.05, P < 0.01)。C~E组的cpm值随GHPS浓度的增加而增加; F~H组cpm值随GHPS浓度的升高而降低。

3 讨论

目前肿瘤的治疗除手术外, 放疗是主要的治疗手段。但放疗缺乏特异性, 在杀死肿瘤细胞的同时, 也损伤正常细胞, 特别是对免疫系统和造血组织的损伤。放疗造成免疫系统和造血组织的抑制则会出现感染、出血等并发症, 加重病情的恶化, 这往往是肿瘤治疗失败的主要原因。因此, 寻找可以拮抗辐射损伤药物的研究越来越多。多糖是生物体内普遍存在的一大类生物大分子, 具有许多重要的生物功能。许多研究者从各种生物体内提取大量活性多糖, 发现多糖具有明显的抗辐射作用, 能显著延长辐射损伤肌体的存活时间, 提高存活率, 拮抗辐射引起的免疫功能低下, 降低造血系统的损害, 清除氧自由基^{[3, 4]}。

本次研究结果表明, 3.7 ×10⁸ Bq的¹³¹I可以抑制大鼠胸腺细胞和脾细胞的增殖, 表现于B组胸腺细胞的自发增殖反应和丝裂原诱导的脾细胞增殖反应比A组显著降低(表 1, 2)。GHPS不仅可以促进胸腺细胞的自发增殖, 也可以促进Con A、LPS刺激的辐射损伤脾细胞的增殖反应。孟庆勇^[5]发现马尾藻多糖可以使辐射损伤的小鼠G1期脾淋巴细胞数量减少, S期和G2/M期增加, 表明马尾藻多糖能促进辐射损伤淋巴细胞的增殖, 与本实验结果一致。从表 1、2看出GHPS可以有效预防大鼠胸腺细胞和脾细胞的辐射损伤, 表现在E~H组胸腺细胞和D~H组脾细胞的cpm值比照射组高。说明GHPS能显著提高辐射损伤大鼠的免疫功能。

海藻多糖抗辐射及对淋巴细胞免疫活性的调节机制尚无定论, 多认为是受体机制。免疫细胞表面存在海藻多糖受体, 可与海藻多糖分子特异性结合, 调节细胞信号转导, 影响基因的表达, 从而调节免疫细胞的活性^[6]。本研究表明在GHPS低浓度范围内GHPS促进细胞增殖作用随着剂量的增加而增加, 在高浓度范围内GHPS促进细胞增殖作用随着剂量的增加而减少。这提示GHPS可能通过受体机制作用于淋巴细胞, 但还有待于进一步研究。