人体外周血淋巴细胞染色体畸变分析, 近年来已普遍应用于辐射损伤、化学诱变、快速初筛抗放射药物、毒理学研究及血液学方面, 特别是对于放射损伤的诊断具有重要价值^[1]。常规培养方法通常按《人类染色体方法学》^[2]进行, 方法比较繁琐, 前期处理要求较高, 成功率较低。本研究旨在建立一种微量、快速、简便的培养方法, 使该项目能够得到推广, 在更基层单位建立与应用。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

RPMI1640、L-谷氨酰胺由美国进口; 小牛血清、秋水仙素、植物血凝素(PHA)购自上海江南生物技术工程有限公司; 12 500单位肝素钠溶液购自常州千红生化制药有限公司; 真空采血管选用国产合格的不含任何添加剂的5 ml普通真空采血管; NU-4500E型CO₂培养箱购自美国。研究血样取自本市放射工作人员体检血样, 畸变类型的判断参照《临床遗传学彩色图谱》^[3]进行。

1.2 方法 1.2.1 培养基的制备与分装

无菌环境下按说明书的用量称取10.5 g或小包装RPMI1640一袋溶于1 000 ml双蒸馏水中, 加入NaCO₃ 1.0 g, 抽滤除菌后加入250 ml小牛血清和0.3 gL-谷氨酰胺, 再加入PHA粉剂20支和12 500单位肝素钠溶液1支, 最后加青、链霉素并使最终浓度为0.1 U/L和100 mg/L, 调pH至7.2左右。用大容量(如50 ml)无菌注射器或者直接用双向采血针向每支真空采血管中分装3.5 ~ 4 ml培养基。开启一下塞子, 使真空采血管恢复常压状态, -20 ℃冰箱保存备用。

1.2.2 接种

无菌注射器严格按无菌操作要求每管接种全血0.3~ 0.5 ml, 混匀。

1.2.3 培养

CO₂培养箱37℃、5%CO₂浓度条件下孵育48 ~ 54 h, 期间每隔6 h可颠倒混匀1次。用CO₂培养箱也可敞开塞子进行培养。

1.2.4 收获

用5 ml无菌注射器每管中加入50 mg/L的秋水仙素使最终浓度为0.4 mg/L, 混匀, 静置保温4~ 6 h, 开弃橡胶塞子后如血沉不好则以600 ~ 800 r/min的低速离心5 ~ 10 min后, 尽量吸弃上清液。然后加入0.075 mol/L的KCl溶液3.5 ml, 小心混匀, 37 ℃水浴箱保温10~ 20 min。取出后加1 ml固定液混匀, 1 500 r/min离心10 min, 吸弃上清液后加3 ml固定液重复固定处理3次。

1.2.5 制片

采用吹片法, 事先把洁净玻片置于水中并冷藏, 使用时再加入少量冰块, 取出冷玻片进行吹片并火焰固定。

1.2.6 镜检与计算

按本室常规法, 镜检时每份标本观察形态良好, 分散度适中的中期细胞100个, 计算畸变率。

1.2.7 统计学分析

采用χ²检验。

2 结果与讨论 2.1 真空采血管的选择

细胞培养对无菌要求较高, 直接关系到细胞的成活与否。常规培养方法使用大量的玻璃器皿, 前期的清洗消毒工作非常繁琐。采用一次性真空采血管可避免培养器材带来的污染。而且, 分装时由于真空采血管本身的负压使操作极为简单、方便。含促凝剂与分离胶的真空采血管严格禁用, 含抗凝剂的与普通型均可。本研究培养基中含有肝素抗凝剂, 所以选用普通型。

2.2 真空采血管内压力的选择

实验中发现如保持管内负压, 则接种血量与后续的秋水仙素的加入量都不易控制, 细胞生长不理想。因此, 选用常压状态。

2.3 培养基的用量

培养基的用量少, 细胞生长受到影响, 过多则造成浪费。实验发现用3.5~ 4 ml培养基较好, 细胞生长良好, 可用于分析的中期分裂象较多。

2.4 接种血量的选择

血量接种过多, 细胞生长欠佳易死亡, 过少则分裂象较少, 难以分析。0.3 ~ 0.5 ml的接种血量能够取得较为满意的结果。

2.5 培养时间

应以48 ~ 54 h为宜, 特别是被检查者是职业性放射工作人员或其他慢性小剂量长期接受照射者, 一般畸变率均较低。如果培养时间加长, 有一些畸变细胞由于机械困难而被迅速丢失, 或成为多倍体存活下来, 其畸变数往往改变或加倍。实验中在其他条件尽可能相同的情况下把30人份放射工作人员的血样每份接种3管, 分别培养51、65、75 h, 发现培养75 h的比培养51 h的畸变率低, 检出率也随时间的延长而降低, 见表 1。

2.6 培养时的温度

温度可影响畸变率, 要严格保持在(37 ± 0.5)℃范围内, 如果超过38 ℃, 不仅畸变率受影响, 而且细胞存活也受到严重影响。国产的生化培养箱或隔水式孵箱温度控制差异较大, 应引起操作者重视。

2.7 培养方式

培养时培养管与水平成小于45°角斜放, 细胞培养温度比较均一, 血沉以后营养液能够均匀覆盖细胞, 有利于细胞贴壁以后生长良好, 期间每隔6 h应摇动1次, 培养效果更好。

2.8 秋水仙素的加入量与保温时间

秋水仙素的加入多少以及加入后的保温时间直接影响到分裂象的好坏, 一般用5 ml无菌注射器注入50 mg/L的秋水仙素使最终浓度为0.4 mg/L。继续保温4 ~ 6 h较为合适, 时间太短可分析的分裂象太少; 时间太长, 分裂象很多但染色体多半缩得太短, 着丝粒开始分离, 不利于染色体的鉴别。目前, 国内也有培养开始时加秋水仙素的方法, 本室将继续加以研究和引用。

2.9 60名放射工作人员与30名对照者染色体畸变分析比较(表 2)

两种方法检测结果经统计学处理, 差异无统计学意义(P < 0.05), 提示微量全血真空采血管培养法检测染色体畸变能取得和常规方法一样的效果。

2.10 畸变类型

实验中发现畸变类型主要有染色单体断裂、断片以及双着丝点, 分别占44.2%、32.8 %和22.4 %, 也有少量的稳定性畸变(如大片段易位)等, 占0.6%。而且, 微量全血真空管法检出的稳定性畸变较本室常规法多。

3 结论

微量全血真空采血管培养法用于染色体畸变分析, 避免了前期准备工作时的大量的清洗消毒工作, 克服了接种与培养时的污染以及玻璃器皿重复使用带来的交叉污染, 提高了培养的成功率。同时, 收获时避免了培养液从培养瓶到离心管的转移, 减少了工作程序和分裂象的丢失, 使检测结果更为准确。而且, 培养基的分装方法简化、用量减少, 节省了人力与成本。用血量的减少, 被检者易于接受。培养时间的缩短, 提高了工作效率。与常规方法相比, 快速、简便、有效, 易被操作者掌握, 值得推广。