心肌肌钙蛋白I是一类调节肌肉收缩功能的蛋白^[1], 正常人血清中cTnI平均浓度 < 0.06 ng/ml。当心肌轻微损伤时其浓度明显升高, 可达100~1300ng/ml^[2]。近年来临床心血管疾病研究结果表明, cTnI是心肌梗死(AMI)和不稳定心绞痛(UAP)、围手术期心肌损伤等疾病的高灵敏、高特异的血清学指标^[3]。随着对cTnI的深入研究, cTnI的检测方法也不断改进。cTnI胶体金免疫层析检测法, 具有简便、快捷、准确等优点, 既适于基础和临床应用研究, 又适于野外、现场诊断^[4]。但目前国内应用这一测定方法的测试盒均为进口或进口原料国内组装, 价格昂贵。因此, 我们在提取人cTnI、制备抗cTnI抗体的基础上, 采用免疫层析技术, 初步建立了cTnI胶体金免疫层析法, 并就其相关的方法学进行了较系统的研究, 为实现试剂盒的国产化奠定了基础。

1 材料与方法 1.1 实验材料

人心肌肌钙蛋白I为中国医学科学院放射医学研究所免疫室制备, 福氏完全佐剂和不完全佐剂为美国Sigma公司进口分装, 辛酸为天津市化学试剂一厂生产, 微孔滤膜、透析袋为美国Sigma公司生产, 氯金酸、柠檬酸三钠为上海试剂一厂生产, 组装测试条所有产品由Millipore公司生产, HRP-羊抗兔IgG为卫生部北京生物制品研究所生产, 其他试剂均为分析纯, 纯系新西兰大耳白家兔为中国医学科学院实验动物研究所饲养。

1.2 方法 1.2.1 抗血清的制备、鉴定及纯化

选取1.8~2kg的新西兰大耳白家兔, 用本室提取的人cTnI作为免疫原, 应用多点皮内注射方法, 经初次免疫和多次加强免疫, 采用间接ELISA法测定抗血清效价, 待其效价达到实验要求, 以颈动脉采血, 离心、分离血清, 经分装后低温冰冻保存备用。cTnI抗血清的纯化:采用辛酸-硫酸铵沉淀法, 将抗血清纯化, 经分装后冰冻保存备用。

1.2.2 cTnI抗体的胶体金标记及条件的选择 1.2.2.1 胶体金制备及鉴定

用去离子水将氯金酸配成浓度为0.01%的溶液, 加热至沸腾, 每100 ml加入2 ml 1%的柠檬酸三钠溶液, 迅速搅拌均匀, 待颜色变成酒红色、稳定不变时, 继续加热10 min, 冷却至室温, 装入试剂瓶中, 保存备用。用紫外可见光光度计在400 nm~700 nm处扫描, 确定最大吸收峰。

1.2.2.2 胶体金标记抗体蛋白浓度的选择^[5]

在6只试管中各加入1 ml pH8.0的胶体金溶液, 然后分别加入10.0μg、7.5μg、5.0μg、3.5μg、2.5μg、1.0μg纯化的cTnI抗体, 室温反应10 min后, 各管加入10%NaCl溶液100μl, 室温静置2h, 于12000 rpm, 4℃, 离心20min, 弃上清, 其沉淀用含1%BSA的PBS溶解, 观察各管沉淀溶解情况及颜色变化, 以沉淀完全溶解成均匀的紫红色透明溶液的最低浓度加20%, 作为最佳标记蛋白浓度。

1.2.2.3 cTnI抗体的胶体金标记^[6]

将纯化cTnI抗体6μg溶于新配制的1 ml pH8.0胶体金溶液中, 室温反应10 min, 2000 rpm 4℃离心20 min, 取其上清液再经12000 rpm 4℃离心20 min, 弃上清, 沉淀溶于100μl含0.2%BSA 0.01 mol pH8.0的PBS中, 制成10%浓缩的胶体金标记物。

1.2.3 免疫测试条的制备及包被抗体浓度的选择^[7] 1.2.3.1 包被蛋白浓度的选择

在硝酸纤维素膜上包被不同浓度纯化的cTnI抗体, 选择最佳抗体浓度来捕捉样品中的抗原; 距cTnI抗体约4mm处包被不同浓度羊抗兔IgG, 来捕捉胶体金标记PcAb作为质控, 选择最佳包被浓度。以上点样均为1 mm宽, 室温干燥后, 用含1%BSA的pH 7.2的PBS封闭, 4℃过夜, 用PBS洗涤3次室温干燥, 待用。

1.2.3.2 测试条的组装

将玻璃纤维浸泡在10%浓缩度的胶体金标记的抗体溶液中。充分浸泡30 min后取出, 室温干燥后待用。整个测试条由样品垫、玻璃纤维结合垫、白色聚苯乙烯塑料垫板(PVC)、粘合胶条、硝酸纤维素膜(NCM)和吸收垫组成。以上各组份首尾互相衔接。

1.2.4 方法学指标 1.2.4.1 灵敏度

将人cTnI稀释成:2ng/ml、5ng/ml、10ng/ml、25ng/ml、100ng/ml、1μg/ml标准系列溶液。将本实验制备的测试条分别插入上述标准系列溶液中, 5s后取出, 观察各含量标准品出现阳性检测带情况, 其中出现阳性检测带的最低cTnI浓度确定为灵敏度。

1.2.4.2 特异性

通过实验观察cTnI与cTnT、cTnC和CK-MB的交叉反应, 来检测其特异性。

1.2.4.3 稳定性实验

将组装好的检测条, 在不同温度下, 放置不同时间后, 再进行检测, 观察其结果。

2 结果

① 用提纯的人cTnI作为免疫原, 免疫家兔, 成功地制备了cTnI抗血清, 其效价为1 : 100 000, Ka =2.38 × 109 L/mol。②用柠檬酸还原法制备的胶体金溶液呈酒红色。通过紫外分光光度计在400~700 nm波段扫描, 结果在520 nm处具有最大吸收峰, 与文献报道一致^[8]。③胶体金标记最佳蛋白浓度为5μg/ml + 20 % ^[5], 即6 μg/ml。见表 1。④经实验确定:胶体金标记物最佳浓缩度为10 %。⑤实验证实:包被cTnI抗体最佳浓度为3.5 mg/ml; 包被羊抗兔IgG最佳浓度为2 mg/ml, 结果见表 2。从表中可以看出:包被浓度为2.0 mg/ml、3.0 mg/ml的羊抗兔IgG抗体与不同浓度cTnI抗体组成检测条, 质控线均有紫红带产生, 所以确定IgG抗体最低包被浓度为2.0 mg/ml; 包被浓度分别为3.0 mg/ml、3.5 mg/ml的cTnI抗体, 检测线均有紫红带产生, 为防止假阳性, 确定cTnI抗体最低包被浓度为3.5 mg/ml。⑥方法学结果:灵敏度:当cTnI浓度等于或高于5 ng/ml时, 检测线为阳性。即将其最低检测值确定为5 ng/ml。特异性:实验结果证实cTnI与cTnT、cTnC以及CK-MB均无交叉反应。稳定性: 37 ℃放置一周, 4 ℃放置12个月的测试条, 测定结果检测线和质控线均在检测范围内, 与新制备测试条测定结果比较无明显差异。

3 讨论

(1) 层析反应是以滤膜为载体, 所以滤膜的质量致关重要, 其吸附性能, 层析速度和均一性等均会影响检测结果, 其中流速是选择硝酸纤维素膜作为免疫层析材料应主要考虑因素之一。国内滤膜很难达到这一质量。因此, 我们选用美国Millipore公司中等灵敏度, 中等流速的HF135膜用于人cTnI胶体金免疫层析法研究, 获得了较满意的结果。

(2) 抗体固定是免疫层析条研制的关键技术, 而抗体包被量的最佳筛选是提高检测灵敏度的重要因素之一^[9]。在不影响灵敏度的前提下, 提高抗体包被量, 可以扩展测定的线性范围。但如果包被抗体量过多, 捕捉的抗原也就多, 如果遇到样品含量非常高时, 消耗标记物过多, 可能导致质控线过浅或根本不显色。相反包被抗体量过少, 检测的线性范围也就窄, 就不能有效捕捉抗原, 则降低灵敏度, 所以, 经筛选确定3.5 mg/ml的抗体浓度作为最佳包被浓度。即可以保证检测的灵敏度和线性范围, 又可以保证质控线正常显色。

(3) 笔者应用提纯的人cTnI作为抗原, 成功地制备了高特异性、高效价的cTnI抗体。在此基础上, 初步建立了cTnI胶体金免疫层析方法, 为实现cTnI检测试剂盒的国产化奠定了基础。