随着各种电器在人们生活中的广泛使用, 以及通讯事业的不断发展, 与微波相关的职业暴露人群也越来越多。国内外流行病学调查和大量实验研究证实, 长期接触环境电磁辐射人群有神经衰弱、失眠、头痛、学习记忆功能下降等中枢神经系统症状, 但对其发生的确切机制, 至今仍未完全揭示^[1]。蛋白激酶C(pro tein kinase C, PKC)调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化, 在跨膜信号传递过程中起着重要作用。近年来, PKC活性、AMPA(α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isox azolepropionicacid, AMPA)受体在中枢神经系统中的作用机制, 成为国内外神经科学领域的研究热点之一。本实验以峰值功率密度为5 W cm²的微波辐照大鼠, 检测大鼠海马PKC活性、AMPA受体表达的变化。

1 材料与方法 1.1 试剂和仪器

微波源(第三军医大学劳动卫生教研室), 液闪测定仪(LS6500型, 美国), 垂直电泳槽(美国Bio-Rad), 蛋白转印槽(美国Bio-Rad), AC-MBP (美国Santa Cruz), 磷酸化AMPA兔多克隆抗体(美国Santa Cruz)。

1.2 动物辐照模型

Wistar大鼠, 雌雄各半, 购自第三军医大学大坪医院实验动物中心, 体重180~220 g。辐照峰值功率密度按公式^[2]测算为5 W cm², 辐照时间为1 h。动物辐照在反射系数近似为零的微波辐照暗室内进行, 实验动物置于可透射微波的有机玻璃盒内, 匀速旋转的实验平台上接受辐照。辐照环境温、湿度保持恒定, 温度(20 ±2)℃, 湿度50%~70%。

1.3 PKC活性检测

36只大鼠完全随机法分为对照组, 辐照组, 辐照组取连续辐照1 d、3 d、5 d、10 d、15 d 5个时相点, 对照组及辐照组各时相点均为6只大鼠, 辐照后直接断头取大鼠海马。参照改良的Takai法^[3], 用蛋白裂解液(Tris.Cl 0.1 M, EDTA 10 mM, DTT 10 mM, Aprotinin 500 μg ml, Leupeptin 500 μg ml, Pepstatin A 500 μg ml, PMSF 10 mM), 分别提取胞浆和胞膜蛋白, 用于PKC活性测定。取胞膜与胞浆蛋白样品各10 μg, 加入激酶测定buffer 25 μl (含AC-MBP)、r-³²P-ATP 5 μl, 30℃作用5 min。之后点样于Whatman滤膜上, 用1%磷酸10ml洗涤三次, 80℃烘干, 5 ml PPO闪烁液, 测定cpm值。PKC活性以样品cpm值-空白cpm值表示。

1.4 AMPA磷酸化抗体表达检测

实验动物18只取材同PKC活性实验, 对照组及辐照组各时相点均为3只大鼠。提取海马组织细胞膜蛋白, 将100 μg蛋白经8%十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳, 将蛋白转印至PVDF膜上, 室温下5%牛血清白蛋白封闭1 h, 首先与1:200一抗(磷酸化AMPA兔多克隆抗体、Santa cruz)4℃过夜, TTBS漂洗, 然后与1:300二抗(羊抗兔, 中山公司)37℃孵育1 h, TTBS漂洗, 最后与1:300三抗(辣根过氧化酶)37℃孵育1 h, TBS漂洗, DAB显色。将显色后的PVDF膜置Gel Doc凝胶扫描系统上分析, 蛋白含量以条带灰度值表示。

1.5 统计学分析

实验数据采用SPSS 10.0软件进行t检验, 取P＜0.05为相差显著, 实验结果用均数±标准差(x ±s)表示。

2 结果 2.1 辐照对肛温和比吸收率的影响

用热电偶点温计测定大鼠在辐照前后即刻肛温, 计算各组大鼠比吸收率(SAR值), 计算公式如下:

公式中C:组织比热, 取0.83kcal/kg℃; ΔT:大鼠在辐射前后肛温变化值; t:辐照时间(s)。由表 1可知, 对照组和辐射组在受照1 h后前后肛温明显升高, 表明低剂量电磁辐射产生了明显的热效应, 该剂量对大鼠的影响以热效应为主。

2.2 微波辐照对海马PKC活性的影响

图 1表明5 W cm²微波累积辐照1 d后PKC活性变化不大, 3 d和5 d后, 细胞膜PKC活性明显增加, 其增加峰值在3 d左右, 且其增幅为50%。随着辐照时间增加, 这种激活形式一直延续至辐照15 d。

2.3 微波辐照对海马磷酸化AMPA受体表达的影响

结果明表, 对照组和辐照组各个时相点的AMPA Glu2-Ser⁸⁸⁰位点的磷酸化程度差异无显著性, 说明5W cm²的微波辐照对大鼠海马中AMPA受体磷酸化的程度影响不大。

3 讨论

蛋白激酶C(PKC)是一类Ca²⁺、磷脂依赖性的蛋白激酶, 在中枢神经系统跨膜信号传递过程中起着重要作用^[4]。PKC通过催化多种蛋白质上Ser Thr磷酸化, 调节多种细胞的代谢、生长、增殖和分化。PKC广泛分布于多种组织、器官和细胞, 静止细胞中PKC主要存在于胞浆中, 当细胞受到刺激后, PKC以Ca²⁺依赖的形式从胞浆中移位到细胞膜上, 此过程称之为转位(translocation)。一般将PKC的转位作为PKC激活的标志。

AMPA受体在中枢神经系统内主要介导快速的兴奋性突触传递, 在信号传导、神经发育以及突触的可塑性(包括学习和记忆)等方面都起着至关重要的作用^[5]。AMPA受体磷酸化作用是该受体发挥作用的主要形式, 研究发现AMPA受体GluR2的磷酸化作用主要由PKC来完成^[6], 其作用位点在GluR2C末端的丝氨酸880位点处。

Chung等人在原代培养的海马神经元中发现, PKC激活能增加GluR2亚基Ser880磷酸化程度, 促进表面GluR2亚基的快速相互作用^[8]。本部分实验结果表明, 5 W cm²微波累积辐照使细胞膜PKC活性增加, 对细胞膜上AMPA磷酸化受体表达量改变无显著影响。PKC的激活可使多种酶和蛋白质磷酸化, 因此微波辐照虽然影响了PKC活性, 但是其影响的并不是AMPA受体(GluR2亚基Ser880)的磷酸化。本研究结果表明峰值功率密度为5W cm²的微波辐照对中枢神经系统的损伤可能不涉及PKC-AMPA途径的功能变化。