染色体畸变分析可以作为生物剂量测定方法估算受辐射人员所受的辐射剂量^[1]。当人体受到一定剂量的电离辐射后, 可见染色体的变化, 即染色体畸变。1962年Bender用照射离体人血的方法, 首先肯定人体细胞染色体畸变量和照射剂量间成正比关系。随后又有大量研究工作表明, 离体照射哺乳动物血细胞诱发的畸变量与活体照射所得的结果近似^{[2, 3]}。利用人体外周血淋巴细胞培养这个体系, 深入研究染色体畸变在辐射损伤中的应用有其重要的价值和现实意义。

1 染色体畸变研究方法

WHO于1973年出版的《人体染色体畸变分析方法》手册和IAEA的“生物剂量测定-用于估算剂量的染色体畸变分析”, 对取材、细胞培养、染色体标本制备、畸变分析以及数据处理等方面提供了标准和规范要求^[4]。

1.1 淋巴细胞培养以及染色体标本制备方法^[5]

目前染色体畸变分析绝大多数是采用外周血淋巴细胞, 常用的培养方法有微量全血培养法。

1.1.1 试剂

RPMI1640培养基, 植物血细胞凝集素(PHA), 血清(小牛血清或AB型血清均可), 肝素, 抗菌素(青霉素、链霉素), 秋水仙素(Colchicine)或乙酰甲基秋水酰碱, 吉姆萨染料(Giemsa), Tris缓冲液, 胰蛋白酶液, 碳酸氢钠、磷酸二氢钾(KH₂ PO₄), 甲醇、冰醋酸。

1.1.2 仪器

电动离心机, 0 ~ 4 000 rpm, 托盘天平和电子天平, 冰箱, 电热恒温培养箱, 电热恒温干燥箱, 无菌操作台, 高压蒸汽灭菌锅, 显微镜, 水浴锅及实验室常用小型器械。

1.1.3 方法

① 采血:采集健康人静脉血1.0 ml, 0.1 ~ 0.2 ml肝素(500 IU/ ml)抗凝, 在采血后24h内进行培养, 也可以直接接种入分装好的培养瓶, 每瓶接种0.2 ~ 0.5 ml全血。每瓶培养液内含有RPMI1640培养液4 ml, 小牛血清1 ml, PHA25 mg(不同批次的PHA效价不同, PHA添加量也有所不同), 肝素(500 IU/ ml) 0.1 ml, 加适量青、链霉素(严格无菌操作时可不加), 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(BrdU), 其最终浓度为5 μg/ ml, 用3.5 %NaHCO₃溶液调pH7.2 ~ 7.4。②培养摇匀后置(37±0.5)℃温箱内避光培养48~ 52 h, 终止培养前2 h, 加纺锤体抑制剂秋水仙素, 其最终浓度为0.07 μg/ ml(根据纺锤体的终浓度决定终止培养时间)。③低渗终止培养后用吸管吸去上层清液, 留下约0.5 ml, 加入8 ~ 10 ml已预热37 ℃的0.075 M的KCl, 充分混匀, 置37 ℃水浴温育10 ~ 15 min或培养箱放置30 ~ 35 min, 取出后即加入固定液0.5 ml混匀预固定, 以1 500 rpm离心7 ~ 10 min。④固定吸去上清液(可分三层, 上层为清液, 中层为红细胞碎片, 最低为白细胞层), 只留下最底层白细胞层, 加入新鲜配制的固定液: (甲醇3:冰醋酸1) 4 ml, 固定20 min, 1 500 rpm离心7 min, 去上清液。再以同法固定一次。⑤制片:吸尽上清液, 加入固定液0.2 ~ 0.5 ml, 混匀后滴片, 每份标本制2 ~ 3张片子(制片前于前一天放置冰箱中冰水预冷), 每片滴上2 ~ 3滴细胞悬液, 吹散, 空气干燥。⑥Giemsa染色:用Giemsa原液加磷酸缓冲液(pH7.3)以1: 8稀释, 将玻片插入染色缸中染色30 min左右, 取出后用水冲洗, 自然干燥。⑦镜检:每份标本选择细胞完整, 图像清晰, 分散度好的中期相。在油镜下计数100 ~ 500个中期细胞。

综合文献中报道的人自发畸变率dic为0.1 ×10^-3 ~ 2.0× 10^-3, 正常均值为1.4×10^-3, ace为2.0×10^-3 ~ 4.5 ×10^-3。自发畸变率不受性别影响, 但随年龄增加有增高趋势。

1.2 G显带法

利用吉姆萨分带染色体技术产生G-带^[6], 能识别过去用标准染色法不能识别的染色体, 并能对单个染色体的各个区段准确地定位, 从而大大促进了染色体型畸变的研究。用外周血制作染色体标本, 置室温3 d左右。用0.85 %生理盐水配制0.25 %胰蛋白酶溶液, 以3 %Tris液调节pH7, 倒入染色缸中, 置(37±0.5)℃。将玻片标本投入胰蛋白酶溶液中, 并不断摆动10~ 30 s左右(如果用0.1 %胰酶溶液, 作用1 ~ 2 min, 以1.5 min为宜), 取出玻片立即用1: 10吉姆萨染液(以pH7.4磷酸缓冲液配制)染色30~ 45 min。水冲洗, 空气干燥。

1.3 荧光原位杂交(FISH) ^[7]技术

将制好的玻片用全着丝粒探针和检测试剂盒进行荧光原位杂交、信号检测与放大、复染, 而后用荧光显微镜观察、计数染色体的数目和荧光染色情况。FISH技术需要价格昂贵的探针和试剂、仪器, 并且受探针覆盖的基因组的限制; 但其操作简便, 对分析者要求不那么高, 同时方法灵敏, 检出率高。

选用全染色体探针进行荧光原位杂交, 需严格按说明书要求操作, 实验过程应特别注意变性温度和清洗液的酸碱度、避光。

1.4 原子力显微镜(AFM)在染色体易位中的应用

原子力显微镜(AFM)作为一种新的成像技术和显微操纵工具在1986年被研制成功^[8], 并逐步应用到在染色体的纳米观测和染色体的显微切割及获取DNA探针等方面^[9~11]。G显带技术与AFM高分辨率三维成像相结合, 识别受辐射者的染色体畸变, 观察损伤热点的结构变化, 同时可进一步利用AFM对染色体损伤热点显微切割、提取DNA进行分子水平研究^[12~14]。AFM与光镜相比, AFM成像的染色体结构能够反映每条染色体特有的带纹, 而且比光镜能识别更多条带^{[12, 14]}。

1.5 染色体畸变分析 1.5.1 常规染色体畸变分析

主要观察非稳定性畸变(Cu), 每例计数200个细胞。染色体数目应达到45个; 染色体不宜过长或过短; 同一细胞内的染色体应分散在一个油镜视野内; 染色体不易扭曲、紧缩成团或重叠过多。所有畸变要认真复查或复核, 以保证体检质量。

1.5.2 G显带核型自动分析

北京放射医学研究所研制了AMMS-1型染色体核型自动分析系统^[7], 将适合分析的细胞输入图像分析系统, 经核型自动配对排列后, 由有经验的工作者进行核对, 然后将全部异常核型储存并打印输出。对少数复杂畸变进行显微摄片, 进行组型分析。

1.5.3 FISH分析^[14]

在荧光显微镜的适当激发光下, 可见标记的1号染色体呈绿色, 其他未标记染色体呈蓝色(DAPI), 着丝粒部位明显折光。如果在1个中期分裂细胞中看到1条染色体上出现2种颜色或2条以上染色体出现绿色, 且排除双着丝粒体(dic)和无着丝粒体(ace)后, 则证明有易位等畸变发生。对所有怀疑具有1号染色体畸变的细胞全部用专门数码相机拍摄, 输入计算机, 做进一步分析。其他染色体的任何畸变均不计数。

1.5.4 畸变标准的确定

染色体畸变包括染色单体型畸变和染色体型畸变。大部分化学诱变剂和环境中一些有害因素均可诱发单体畸变, 故一般认为单体型畸变对评价辐射效应意义不大。染色体型畸变可以分双着丝粒(dic)、着丝粒环(r)、无着丝粒断片(ace)等非稳定性畸变(Cu), 以及易位(t)、倒位(inv)和缺失(del)等稳定性畸变(Cs)。作为辐射远后效应效价或剂量重建时则用t。用于生物剂量测定的畸变有dic、r和ace。其中以dic或d +r用来估算剂量较为准确^[15]。常规方法以观察Cu为主, G显带核型分析以Cs为主, FISH方法主要观察t等Cs畸变。染色体畸变细胞符合二项分布。若已知畸变细胞率和允许误差, 可根据二项分布95%可信限公式求出应计数的细胞数。一般允许误差多采用20 %, 公式为: 式中, p:畸变细胞率(畸变细胞出现的份额), n :分析细胞个数^[15]。FISH观察的畸变结果用Lucas等^[16]的公式Fp =2.05fp(1-fp) FG计算全基因组畸变率。其中f_p为FISH检测的畸变率(畸变率观察细胞数), Fp为1号探针占全基因组的份额, 男性取8. 2 %^[17], FG为全基因组畸变率。

2 染色体畸变在生物剂量估算中的应用 2.1 染色体畸变可作为慢性小剂量辐射生物效应的特异性敏感指标

随着人们对电离辐射认识的不断深化, 辐射的防护越来越得到重视, 放射工作人员长期小剂量辐射后外周血淋巴细胞染色体可能会发生畸变, 这一指标在《放射工作人员健康管理规定》已被认为是在电离辐射生物效应中具有特异性的敏感指标, 并在一定范围内与照射剂量呈正相关^[18]。仲志鸿^[19]利用染色体畸变研究方法对放射工作人员外周血淋巴细胞进行了测定, 发现人体外周血淋巴细胞染色体对放射线有较高的敏感性, 放射组与对照组相比, 染色体畸变率、总断裂率和畸变细胞率明显升高, 差异非常显著, 畸变类型以染色体型断片检出率为最高。慢性小剂量照射下的剂量效应关系, 一般认为X线工作人员的检查中, 累积剂量低于100 mGy时, 染色体畸变基本上没有明显改变, 当剂量>100 mGy时, 染色体畸变就可明显增加。冯亚乐^[20]通过外周血淋巴细胞染色体的测定, 发现放射工作人员累积剂量在5.6 ~ 1 600 mGy范围内, 染色体型畸变率随累积剂量的增加而增加, 两者之间呈正相关。同时还发现畸变率的多少与人体受到的辐射在一定范围内有随着放射工龄增加而升高的趋势。

2.2 在事故剂量估算中的应用

染色体畸变分析作为生物剂量测定方法, 首先要在离体条件下, 用不同剂量照射健康人血, 根据畸变量与照射剂量的关系制作刻度曲线。当发生事故时, 取受照者的血, 在标准条件下进行培养、制片及畸变分析, 根据所得的dic或d +r的频率, 从相应射线所建立的刻度曲线回归方程估算人员所受的剂量。用染色体畸变分析方法估算剂量的范围一般为0.5~ 5 Gy, 北京放射医学研究所的陈英教授等已建立新的曲线, 将估算范围拓宽到22 Gy, 并且与物理剂量吻合很好。可能估算的最低值, γ辐射约0.1 Gy, X射线约0.05 Gy, 裂变中子约0.01 Gy。

2.3 事故剂量估算的应用评价

辐射事故中, 若未佩戴个人剂量计、无法用物理方法提供剂量时, 或者估算的剂量与临床表现不符合时, 染色体畸变分析被认为是较为灵敏、估算剂量较可靠的首选方法。其可靠性已通过实际应用的剂量数据得到确认, 其剂量-效应关系以及各种影响因素已摸清, 用于剂量估算的畸变dic易于识别, 具有辐射特异性, 根据这种畸变在细胞间的统计分布, 可以估计全身照射的非均匀程度。而且利用dic畸变易于识别的特点, 可以建立计算机图像自动计数。此法的不足之处是培养费时较久, 最快在取血后60 h给出估算剂量。

近年来国外相继发生的几起事故, 如1986年切尔诺贝利核电站事故、1987年巴西Goiania铯源事故以及1989年San Salvador钴源事故都有染色体畸变分析作为生物剂量测定方法的报道。我国自20世纪70年代以来, 已先后报道了X、γ射线、快中子、裂变中子以及核爆炸瞬时辐射照射离体人血的畸变量与照射剂量关系的刻度曲线, 作为事故生物剂量估算的依据, 并已在几起辐射事故中得到实际应用^{[21, 22]}。