目前人类对温室气体排放的担心使得核能正日益受到各国重视, 我国的核电将由适度发展战略向积极发展战略迈进, 在未来的电力发展中扮演十分重要的角色。美国“九.一一”恐怖袭击发生后, 为防患于未然我国已经制定防止核和辐射恐怖袭击事件的医学应急预案; 随着科技的发展, 放射源和辐射技术在工农业、医学和教学等领域有着广泛的应用, 这一切都使人类不可避免地受到来自于电离辐射的可能危害。电离辐射对健康的危害和核电站及其他核设施的辐射安全评估, 核(放射)突发事件以及核和辐射恐怖袭击等各种情况下的辐射损伤分类、诊断和救治等都需要确定受照射剂量。正确测定受照射剂量, 可以通过物理剂量和生物剂量互相补充, 得出较正确的数值。但是, 在一些偶然、突发放射性事件情况下, 物理剂量不易及时得到, 这样就会影响及时有效地救治, 影响对辐射生物效应和健康影响的评价。
生物剂量测量是指利用体内某些敏感的辐射生物效应指标来反映人体受照射的剂量, 这些敏感指标称为生物剂量计。来自于生物剂量的信息不仅有助于在事故时决定剂量分布, 而且还是对受照人员进行分类、诊断和治疗的重要依据; 人群的生物剂量信息还有助于对急、慢性暴露的远期效应进行评估。
1 生物剂量学方法概述最初的辐射生物剂量学方法主要用于人群急性照射, 一般剂量相对很大, 如原子弹爆炸幸存者、切尔诺贝利事故受害者以及放疗病人, 目前人们热衷于对低剂量、慢性受照人群和辐射从业人员剂量估算的生物剂量学方法研究, 比如对俄罗斯的Techa河附近的居民[1]以及美国华盛顿州的Hanford后处理厂[2]和英国的Sellafield核电站附近居民及从业人员的人群研究[3]。另外也在尝试寻找对高密度电离辐射如氡释放的α粒子或宇宙射线的重离子等特异的生物分析方法[4]。在室内高氡地区、飞机机组成员在空中飞行时、在航天飞行站或执行火星计划等情况下高密度电离辐射则随处可见。
实用的生物剂量计应有的特征:分析时间十分关键, 尤其在核、放射性事故或核和辐射恐怖袭击的情况下剂量学方法应尽快并且在大范围内应用, 在很短的时间内, 根据估算出受照剂量对受照人员进行合理的处置, 及时将受过量照射的病员从现场撤离, 因此就需要分析方法能够自动化大通量进行, 那些需要专家来进行的分析方法则很不实用。另外, 应考虑受照射后多久进行分析还能提供可信的剂量估算值, 现有的一些方法适用于急性受照射后几小时到几天, 有些则在数年后仍可进行剂量估算。同时, 对于任何一个生物剂量标志物来说, 重要的是遗传背景稳定, 本底变异较低。理想的生物标志物, 应对电离辐射具有特异性, 但不幸的是目前已有的标志物大多受年龄、吸烟或其他环境毒物影响, 对高LET射线的辐射来说更适用。最后, 就是要有特异、良好的量效关系。虽然有一些生物剂量计已经通过动物实验和放疗病人建立了剂量-效应关系, 但是多数生物剂量学方法是依赖于离体实验来建立标准曲线。如果考虑到以上这些影响因素, 目前尚无一个完美的生物标志物。
2 现有生物剂量学方法人体的造血系统有一些对辐射敏感且易于取样的细胞, 目前的生物剂量学方法中的体细胞突变、细胞遗传学和基因表达等就是通过对人外周血细胞的检测来估算受照剂量。最早、最直接的剂量估算方法是计数每天人外周血中不同细胞的细胞数, 受照剂量超过1 Gy白细胞总数在第一周急剧下降, 细胞减少程度和持续时间以及后来的恢复都与剂量密切相关[5]。全身照射剂量超过1 Gy时, 人外周血中中性粒细胞的计数也能很好地反应受照剂量。以上两种方法在俄罗斯的切尔诺贝利事故以及其他核(放射)事故中曾广泛应用, 有很好的一致性[6]。
2.1 细胞遗传学方法 2.1.1 双着丝粒分析电离辐射是强致断裂剂, 使受照细胞染色体断裂, 导致细胞遗传学异常。因此, 许多细胞遗传学方法用于放射性事故如切尔诺贝利事故等辐射剂量的估算, 并且与物理剂量计或ESR测量的剂量相符[5~7]。
细胞遗传学方法中的双着丝粒分析是应用最为广泛的电离辐射生物剂量计, 并且一直被认为是对电离辐射损伤最特异的分析方法[8]。从受照人员外周血血样中将淋巴细胞分离, 并在培养过程中刺激它分裂。然后, 通过染色或着丝粒标记的荧光原位杂交(Fluorescence in Situ Hybridization, FISH)探针技术, 计数中期染色体分布, 观察具有两个着丝粒即双着丝粒染色体的频率。通过与对人外周血淋巴细胞(PBL)离体照射建立的标准曲线进行比较, 估算所受辐照剂量。虽然离体照射剂量超过0.02 Gy[9], 双着丝粒就明显上升, 而实际活体照射的测量限值却接近0.5 Gy[6]。对放疗病人的研究也表明活体辐照产生的双着丝粒量, 确实颇少于通过离体照射建立的标准曲线得到的估算值。
着丝粒位于染色体有丝分裂时纺锤体的部位, 如果染色体有两个着丝粒, 在有丝分裂时就不能顺利地分裂为两条染色单体。这意味着双着丝粒为不稳定性畸变, 人外周血中具有双着丝粒染色体的淋巴细胞随着时间的推移而逐渐减少, 但是减少的分裂动力学原理尚不完全清楚。巴西Goiania放射性事故时, 对15名受害者的研究表明, 双着丝粒的减少与最初的受照剂量有关, 最初的受照剂量高则有双着丝粒染色体的淋巴细胞减少很快, 而最初的受照剂量低则产生很多稳定的双着丝粒染色体[10]。尽管该方法在受照后由于双着丝粒减少, 而影响对辐射剂量的估算, 但是双着丝粒自然发生频率低, 在暴露后短期内仍是一个最实用的生物剂量评估指标。
2.1.2 微核分析生物剂量学中的另外一种细胞遗传学分析方法就是计数间期细胞中微核出现的频率。与染色体双着丝粒分析相比, 微核分析方法的优点是操作简单, 分析快速, 适合大规模人群监测。在这一分析方法中, 受照人员外周血中淋巴细胞在体外丝裂源刺激培养后用细胞松弛素-B(Cyt-B)阻断, 导致有丝分裂和核分裂而细胞胞质的分裂被阻断即无细胞分裂, 于是计数双核细胞中出现在细胞核外的小块染色质即微核。然而, 微核分析方法并不象双着丝粒分析方法那样对电离辐射十分特异, 吸烟等其他的致断裂剂也能诱发微核。大多数自发的微核有着丝粒, 电离辐射诱发的微核主要为无着丝粒染色体断片形成的。着丝粒标记FISH探针的引入, 可以很快计数只有无着丝粒微核, 增强了微核分析方法的特异性, 而且使该方法的分析剂量范围降低到0.1~ 0.2 Gy[11]。
2.1.3 早熟染色体凝集(PCC)分析传统的PCC方法是将要检测的细胞与分裂中细胞融合, 利用分裂中细胞携带的信息使核膜溶解和间期染色体凝集, 诱导细胞处于有丝分裂的准备阶段。当间期染色体中有断裂发生时, 通过Giemsa染色就可以观察到46条染色体以外的断片。最近, 利用化学诱导PCC与FISH探针染色体涂染技术相结合, 提高了分析速度和准确性, PCC断片随着受照剂量的增加而上升[12]。常规的染色体分析观察的是分裂期细胞的畸变, 而PCC的优点在于可诱导静止期细胞的分裂, 因此增加了分析细胞数量, 加宽了适用剂量范围。
2.2 体细胞突变分析电离辐射诱导造血干细胞中DNA损伤可导致编码关键蛋白的一些基因位点突变, 可以作为剂量监测的生物标志物。一些不同基因位点的突变, 包括血红蛋白(Hb)、血型糖蛋白A (GPA)、人白细胞抗原(HLA)、T细胞抗原受体(TCR)和T淋巴细胞的次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)等, 已经用于辐射暴露的监测指标。这些体细胞突变普遍存在的一个缺点是对辐照缺乏相对的特异性, 其他的环境毒物等暴露也能观察到突变频率的上升。
2.2.1 GPA变异红细胞的GPA分析已广泛用于生物剂量学。尽管成熟的红细胞没有细胞核, 但是发生在骨髓前体细胞的突变, 可以通过检测外周血红细胞表型的变化来监测。GPA的两个等位基因编码红细胞表面的M和N血型糖蛋白, 电离辐射诱导骨髓前体细胞GPA基因突变, 可能导致等位基因缺失不表达或仅一个位点表达, 当GPA为杂合子时可以快速通过流式细胞仪定量只有一种等位基因表达的红细胞。这种方法的明显缺欠是, 只适合于约50 %M/N杂合子人群的分析。骨髓前体细胞的突变可以在骨髓中存留数年, 高剂量急性暴露的原爆幸存者和切尔诺贝利事故受害者以及低剂量率暴露的131 I治疗病人受照后数年, 发现GPA变异有明显的剂量效应关系[7, 13, 14]。但是, 在英国的Sellafield核电站职工中未发现剂量相关性[3], 这可能与只有在相对高的检测剂量限值(约1~ 2 Gy)才有明显的GPA变异有关[3, 15, 16]。
2.2.2 HPRT基因突变及突变谱HPRT基因的功能性失活在T细胞生物剂量学分析中应用最广泛。与红细胞分析相比, T细胞分析监测的是直接发生在外周血细胞的突变。HPRT基因编码的是DNA合成补救通路上, 催化次黄嘌呤和鸟嘌呤磷酸核糖基化的磷酸核糖转移酶, 它也催化嘌呤类似物如6-巯基鸟嘌呤(6-TG), 6-TG参入DNA则导致细胞死亡。突变的细胞失去酶的活性, 可以在一定浓度6-TG存在环境中生存, 而野生型则不能, 因此通过计数受照细胞在6-TG存在的培养基中选择性生长的克隆生长率可估算受照剂量。另外, HPRT基因位于人X染色体上, 意味着它在功能上是半合子, 通过测定其等位基因的缺失频率也可进行剂量估算。对原爆幸存者和接受高剂量辐照的放疗病人研究中, 利用HPRT基因突变的T细胞克隆和对HPRT基因缺失、断片分析, HPRT突变率与受照剂量间存在很好的剂量效应关系[17, 18]。低剂量暴露时, 也可以检测到HPRT基因缺失、断片的增加, 但是检测结果与取样时间密切相关[18]。
在探讨电离辐射所致人体遗传学损伤的机理以及损伤后的远期效应评估中, 染色体只能反映本身可见的基因组损伤, 检测结束后细胞被固定不能进一步对突变基因本质进行分析。HPRT基因位点突变分析刚好补充了染色体微核的不足之处, 它的特点是可以进行分子水平的研究, 经特殊电泳分析即可判断不同诱变剂所致的HPRT基因突变的DNA特异损伤图谱; 反之, 也可通过HPRT基因图谱分析来推测所致突变的诱变剂, 再通过PCR扩增技术对部分特意基因片段进行增殖、放大, 从而进一步分析突变发生的机理。它的另一个特点是, 电离辐射引起的HPRT基因位点突变是不可逆的突变, 由于这种不可逆性, 使得HPRT基因位点突变能长期存在于体内, 因而在受照后多年检测, 仍能反映体内受照剂量。故HPRT基因位点突变分析在辐射生物效应研究中仍有很大的潜力。HPRT基因突变T细胞克隆分析的又一优点是体内突变分子分析的潜在可能性, 继之确定诱发与自发HPRT基因突变谱, 增强该分析的特异性。自发HPRT基因突变有很宽的点突变和缺失范围[19, 20], 但放疗病人个体却可以观察到大体结构改变的X染色体的增加, 同时可观察到缺失大小和频率与剂量相关[21]。氡离体照射人T细胞导致小片段缺失增多而整个基因缺失率低, 表明HPRT基因突变谱依赖于LET组成。尽管HPRT基因的大多数分子突变谱来源于离体照射, 但与活体照射资料之间存在很好的一致性[21]。
T细胞克隆分析的缺点是T细胞克隆时间比较长, 但是利用免疫荧光法[22, 23]可以快速定量分析体内HPRT基因突变。这种分析方法是用丝裂源PHA短期刺激细胞分裂, 培养基中有6- TG存在时, 只有HPRT失活细胞才会掺入3H标记的脱氧胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)或2, 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Brdu), 与适应于1 ~ 2Gy相对高剂量监测限值的GPA分析而言, HPRT基因突变分析更适于低剂量辐照的剂量估算[24]。
2.3 基因表达 2.3.1 生长抑制和DNA损伤诱导基因45(growth arrest and DNA-damage inducible gene, GADD45)电离辐射诱导一些特殊基因表达的改变, 有可能作为新的分子生物标记物用于估算受照剂量。目前, 调控细胞G1期阻滞的p53下游效应基因GADD45[25]尤其引人关注。GADD45是细胞和DNA损伤的应激基因, 在电离辐射、紫外线、多种DNA碱基损伤剂和诱变剂等的刺激下诱导表达增强, 诱导受损细胞停滞于G1期, 抑制细胞进入S期进行DNA复制及细胞增殖[26], 人和哺乳动物细胞GADD45基因表达改变是目前国际上研究非常活跃的课题之一。GADD45是p53的下游基因之一, 在辐射诱导的细胞调亡、细胞周期阻滞及DNA修复中起重要作用。它位于人类1号染色体短臂上, 其mRNA全长1355 bp, 在人体细胞中广泛、稳定表达, 是已知的电离辐射效应基因之一[27]。在大多数p53野生型的细胞中, 辐射以p53依赖的方式诱导GADD45的表达。GADD45第三内含子区有p53蛋白的共同序列, p53蛋白与之结合后, 以增强子的方式在转录水平调节GADD45的表达[27]。
根据生物剂量计的要求和放射生物学的特点, 对一种基因的检测方法是否能成为一种新的生物剂量计, 主要是该基因的特异性、重复性、影响因素及剂量效应关系等。GADD45是一个对多种电离辐射敏感的基因, 在人体细胞中广泛、稳定表达, 高、中、低剂量范围内测定该基因表达都有较好的剂量效应关系[25, 28~31], 2 cGy即可以检测到变化, 而且检测样本易得[28]。应用实时定量RT-PCR方法, 快速、敏感、不受标本量限制, 适合作为生物剂量计应用。
2.3.2 cDNA基因微阵列分析近来分析技术的发展, 使一些细胞对电离辐射的分子水平应答得以利用。细胞暴露于DNA损伤剂可以导致高度复杂的分子应答, 其中很多都是通过基因表达的改变来介导的。对遗传毒性应激反应的转录应答, 最初在对酵母的研究中估计涉及1%或更多的基因组, 同样在哺乳动物细胞中很快得到了验证[32]。对不同环境或生理应激反应的应答通路有很多重叠组分, 包括生长因子、细胞因子、癌基因和细胞周期涉及基因、凋亡、信号通路和DNA修复。最近发展起来的功能基因组学的研究方法可以同时定量成千上万基因的表达, 确定明显表达的标志物, 从而指示暴露于电离辐射或其他环境毒物。此方法可以自动化大通量、无损伤进行分析, 并且可能有潜力分辨不同性质辐射或化学和物理因素混合暴露的竞争效应。目前有一些可以大通量测量基因表达的方法, 如基因表达序列分析(serial analysis of gene expression, SAGE)、寡聚核苷酸分析和cDNA分析。Amundson等[33~36]利用cDNA微阵列杂交技术就辐射诱导基因改变作了大量工作, 并取得了相当的进展, 但是要归类和建立一组特异的用作标识辐射剂量的电离辐射应答基因表达谱尚有许多工作要做。
综上所述, 现有的生物剂量学方法中存在的关键问题是没有一个完美的生物标志物, 特别是对于低剂量、低剂量率慢性辐射暴露, 鉴于各种方法各有其有缺点, 因此进一步精化(refinement)现有的方法十分必要, 就细胞遗传学方法而言, 比如PCC、双着丝粒和染色体畸变的计数借助于FISH探针技术可以提高原有方法的准确性, 降低适用分析剂量的阈值[37];另外, 随着检测和分析手段的日益完善, 尤其是基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学的研究技术方法整合在一起, 对生物剂量学方法的研究也将起到巨大的推动作用。
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