风疹(rubella)是由风疹病毒(Rubella virus, RV)感染引起的一种急性呼吸道传染病, 是发疹性疾病。国外许多国家和地区对学龄前儿童、青少年和育龄妇女广泛接种风疹疫苗, 因此风疹的发病率很低, 但我国风疹疫苗接种未并入计划免疫, 仍有风疹的发生和流行^[1]。笔者应用自制的酶联免疫吸附实验(ELISA)试剂盒对济南地区514名放射工作人员进行抗风疹病毒IgM和IgG抗体检测, 以了解放射工作人员风疹病毒感染情况, 报告如下。

1 材料和方法 1.1 材料

风疹病毒抗原购于中国预防医学科学院病毒研究所。辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(γ链)和IgM(μ链)购于sigma公司。类风湿因子免疫胶乳试剂盒由上海捷门生物技术合作公司提供。

1.2 标本来源

514名济南地区放射工作人员健康查体血标本, 由山东省医学科学院放射所提供, 抽取静脉血2 ml, 分离出血清, 置-20℃冰箱保存。类风湿因子阳性血清来自济南市各大医院。

1.3 试剂盒的制备

用方阵滴定法确定的风疹病毒抗原最佳包被浓度为1: 300, 每孔50 μl加于酶标板孔内, 4 ℃过夜, 次日甩掉多余的液体, PBS加吐温-20洗涤液洗一次, 加封闭液1001μl (pH7.2、0.01 mmol/L PBS加0.5%牛血清白蛋白), 37 ℃ 2 h。液体甩掉, 室温除湿干燥, 干燥后板条用密闭包装, 4 ℃保存。试剂盒中除洗涤液需用前1: 40稀释外, 其他所有试剂都稀释到应用浓度, 并用翻盖滴瓶分装, 可直接使用。

1.4 风疹病毒抗体检测步骤

① 检测RV-IgM的加样:在包被好的酶标板的孔中滴加1滴(50μl)IgM样本稀释液, 再加稀释好的血清标本10 μl(0.4 ml生理盐水加10μl血清混匀后), ②检测RV-IgG的加样:0.4 ml生理盐水加10 μl血清, 混匀后, 取50 μl加在酶标板相应孔内, ③阴性、阳性对照血清直接加一滴(50μl)于相应孔中, ④37℃ 15 min, 洗板5次, 拍干, ⑤加酶结合物1滴(50 μl), 37 ℃15 min, 洗板5次, 拍干, ⑥加显色剂A液(H₂O₂)、B液(TMB)各1滴, 37℃ 10 min观察结果, ⑦结果判断: (1)目测:出现明显兰色的孔判为阳性, 无色或淡兰色为阴性。(2)机测:用2N的H₂SO₄终止, 用酶标仪测定各孔OD₄₅₀值。OD₄₅₀值＞2.1×阴性对照平均OD值判为阳性, 否则为阴性。

2 结果 2.1 514例济南地区放射工作人员血清风疹病毒抗体检测结果(表 1)

从表 1可以看出, 有6.42%(33/514)的放射工作人员对风疹病毒不具有抵抗力, 为易感者; 2.33%(12/514)的放射工作人员呈现单项IgM阳性, 为原发感染; 放射工作人员90.47% (465/514)呈单项IgG阳性, 提示对风疹病毒具有抵抗力; 有0.78 %(4/514)的放射工作人员IgG和IgM抗体均呈阳性, 提示为再次感染。

2.2 特异性检测 2.2.1 RV-IgG和RV-IgM阳性血清

各一份分别按1: 50、1: 100、1: 200、1: 400滴度稀释, 然后做检测, 可得到良好的剂量依赖曲线。

2.2.2 特异性抗体阻断试验

取RV-IgM和IgG阳性血清各1份, 按风疹病毒抗体检测步骤稀释标本后, 加入相应的抗原(0.5 mg/mL)等量混合, 37 ℃中和30 min, 做ELISA检测, 结果测得OD值与对照相比阻断率至少减少50 %以上, 说明本试剂盒检测的IgM和IgG为RV的特异性抗体。见表 2

2.2.3 类风湿因子(RF)对特异性IgM试验的干扰

临床上检测为类风湿因子(RF)阳性的血清32份, 应用自制的试剂盒检测其RV-IgM抗体, 结果只有一份RF阳性标本, RV-IgM呈阳性; RV-IgM阳性血清10份标本, 用RF乳胶凝集试剂检测, 结果没有检测出RF阳性标本, 说明类风湿因子对本试剂干扰不大。

2.3 重复性试验

① 相同批号试剂盒测定:取RV-IgG和IgM阳性血清各一份, 用相应的试剂盒连续测定10孔, 测OD值, 检测RV-IgG和IgM的变异系数(C.V)分别是10.2%、7.9%。②不同批号试剂盒测定:RV-IgG和IgM阳性血清各一份血清, 用相应的3个不同批号的整套试剂各作5次测定, OD值取平均数, 测得的变异系数为6.2%、8.4%。从以上结果表明变异系数均小于15%。

2.4 稳定性试验

将试剂盒内的预包被酶标板、阴性和阳性对照血清、样品稀释液、酶结合物、×40浓缩洗涤液、显色剂、终止液全部试剂放入37℃温箱烤3 d后, 与同时4℃存放的试剂盒比较, 每份标本平行测定5次, OD值取平均值, 检测RVIgG和RV-IgM的阴性、阳性标本变化率分别为6.2%, 7.3%;9. 0 %、-1.6 %, 变化率均小于15 %, 说明试剂盒稳定性良好。

3 讨论

传统ELISA间接法检测血清中IgM时, 易受到类风湿因子(RF)和特异性IgG的干扰, 容易出现假阳性结果, 我们建立的RV-IgM抗体ELISA试剂盒在样本稀释液中加入了适量的特定吸附剂羊抗人IgG血清, 去除这些因素的干扰^[2], 应用本试剂盒对32份类风湿因子阳性标本进行RV-IgM检测, 结果只有一份呈RV-IgM阳性; 我们用本试剂盒检测出的RV-IgM抗体阳性的10份血清, 进行了RF检测, 结果没有一份RF阳性, 说明加入了适量的特定吸附剂后, 类风湿因子对本试剂盒干扰不大, 从而提高了实验的特异性和敏感性。

目前我国还没有正式颁发风疹病毒抗体ELISA试剂盒的质量检定, 我们参照已颁布的其他的ELISA诊断试剂盒的质量规程进行检定, 本试剂盒RV-IgG和IgM批内变异系数分别是10.2%、7.9%, 批间变异系数分别是6.2%、8.4 %, 变异系数均小于15%, 说明本试剂重复性好; 整套试剂37 ℃存放3 d(相当于4 ℃存放6个月), 与同时4℃存放的试剂盒比较, 变化率均在15%以内, 结果说明试剂盒稳定性良好; 通过阳性血清系列稀释后检测得到良好的剂量依赖曲线, 以及特异性抗体阻断试验, 说明本试剂盒具有良好的特异性和敏感性。以上结果表明我们研制的试剂盒质量良好, 符合酶联试剂盒的基本要求^[3]。

我国不同地区人群风疹抗体水平有差异, 总阳性率为90.9%~ 97.5 %^[4], 我们用自制的试剂盒对济南地区514名放射工作人员进行风疹抗体检测, 总阳性率为93.58%。

我们通过检测发现济南地区514名放射工作人员有6.42%为风疹病毒易感者; 2.33%的放射工作人员原发感染了风疹病毒; 90.47 %的放射人员呈单项IgG阳性, 对风疹病毒具有抵抗力; 0.78%的放射工作人员IgG和IgM抗体均呈阳性, 为再次感染风疹病毒。

1994年, 美国风疹大流行从而推动了风疹减毒疫苗的迅速发展, 截止2000年4月, 已有111个国家将风疹疫苗纳入国家免疫计划。我国不在这些国家之列, 虽然这次调查中有90.47%的放射工作人员能够抵抗风疹病毒的感染, 但还有6.42%的放射工作人员存在风疹病毒感染的危险, 说明放射工作人员的风疹抗体还存在一定的免疫空白, 建议对他们开展风疹疫苗免疫, 消除风疹感染的危险性。