2. 山东大学齐鲁医院;
3. 山东省医学科学院基础医学研究所
外周血干细胞移植是救治急性放射病最有效的手段之一，正常情况下外周血干细胞(peripheral blood stem cell, PBSC)的数量通常很低[1]，远远不能满足造血干细胞移植时所需数量，因此需要进行动员才能获取足够数量的造血干细胞以保证移植成功。Craddock[2]发现抗VLA-4单克隆抗体能成功动员小鼠的PBSC, 且具高效性和潜在优越性的特点，国内在粘附分子抗体动员PBSC方面的研究目前尚未见报道。本研究初步观察了抗VLA-4单克隆抗体动员出的PBSC对放射损伤小鼠的救治作用, 现报道如下。
1 材料和方法 1.1 实验动物8 ~ 12周龄的近交系BALB/c小鼠，体重18 ~ 22g, 购自山东大学实验动物中心，雌、雄性各半。
1.2 药物纯化抗鼠VLA-4单克隆抗体(不含叠氮钠/低内毒素）, 制剂标示量为500μg/支，购自美国BD公司。给药前用生理盐水稀释至所需浓度。
1.3 PBSC动员和采集雄性小鼠为供体组，分别予以生理盐水0.4ml；只、抗VLA-4单克隆抗体2 mg/kg·d皮下注射3 d。第4天摘除小鼠眼球取血并定量, 经肝素(25U/ml)抗凝，进行白细胞计数和分类，采用Ficoll-Hypague(相对密度为1.077)离心取单个核细胞(PBMNC), 洗涤后作为PBSC收集物备用。
1.4 放射病模型及治疗分组雌性小鼠置于特制的弧形有机玻璃容器内，经8.5Gy的60Co γ射线照射，剂量率为0.7 Cy/ min; 照射后4 ~ 6 h实验1组实验2组分别由尾静脉注射经生理盐水、抗VLA-4单克隆抗体动员出的2 × 106个PBMNC, 对照组由尾静脉注射生理盐水0.4ml, 移植后小鼠在无菌层流架内饲养4周。
1.5 外周白细胞(WBC)测定及存活率观察移植后小鼠定期尾静脉取血20 μl，稀释后用F-820血细胞自动计数仪计数白细胞; 观察小鼠移植后4周存活率。
1.6 骨髄有核细胞计数在移植后的4, 7, 12, 24 d处死小鼠，无菌条件下分离股骨, RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，过4号针头，制成骨髓悬液计数备用
1.7 受体组小鼠X、Y染色体嵌合体观察移植后7 d和24 d，受体组小鼠尾静脉注射秋水仙碱7 μg/kg, 5 h后颈椎脱臼处死小鼠, 无菌条件下取出双侧股骨，RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，经过4号针头，制成骨髓单个核细胞悬液。以1 000转/ min, 离心10 min, 吸弃上清液，加入预温至37℃的0.075 mol/L氯化钾溶液中，置37℃温箱20 min; 加入1:3醋酸、甲醇固定液1ml, 吹打均匀，1 000转/min, 离心10 min, 弃上清液，留固定液0.5~1 ml, 滴片, 晾干。Giemsa染液染色水洗、晾干后，显微镜下观察20 ~ 30个分裂相，计数X与Y染色体嵌合体数。
1.8 粒细胞巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)测定参照文献[3]方法略有改进, 培养体系包括2 × 105/ml骨髓有核细胞，0.9%甲基纤维素，20%胎牛血清，1 %脱离子牛血清清蛋白(Sigma公司）和50 ng/ml的rhG-CSF, 充分混合后，接种于24孔板，每孔0.5 ml, 每组设3个复份，置5% CO2, 37℃的培养箱中培养7 d后, 于倒置显微镜下计数CFU-GM。
1.9 脾集落形成单位(CFU-S)观察移植后12 d颈椎脱臼处死小鼠，分离脾脏，浸于Boon's溶液10 min, 在解剖镜下计数脾脏表面的白色结节数即CFU-S。
1.10 统计学方法采用SPSS10.0统计软件对数据进行方差分析和t检验，均数±标准差以x ± s表示，存活率以%表示。
2 结果 2.1 移植后小鼠4周存活率对照组小鼠在移植后4~ 16 d内全部死亡，存活率为0(0/12);实验1组小鼠移植后4周存活率为8.3%(2/24)，明显高于对照组（P < 0.05);实验2组存活时间均大于20 d, 存活率为70.8%(17/24), 明显高于对照组和实验1组（P < 0.01)。
2.2 移植后小鼠WBC测定(表 1、图 1)辐射后小鼠活动明显减少、饮食量明显下降，体重亦下降; 辐射后3 ~7 d外周血WBC数降至最低点，对照组小鼠移植后2周WBC有一定程度恢复，但死亡小鼠死亡前WBC数均小于0.5 × 109/L; 实验1组移植后1周WBC开始上升，存活小鼠外周血WBC在第4周基本恢复至1.5 × 109/L; 实验2组移植后小鼠WBC最低值明显高于对照组和实验1组的最低值（P < 0.01), 移植后1周WBC开始上升, 较实验1组提前10~ 14 d升至1.5 × 109/L, 存活小鼠外周血WBC在第3周基本恢复正常。
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表 1 移植后不同时间外周血WBC计数（× 109/L) |
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图 1 各组小鼠移植后外周血白细胞数的变化 |
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表 2 移植后不同时间骨髓有核细胞计数（×106/根股骨) |
实验2组在移植后7、12、24d骨髓有核细胞数均明显高于实验1组（P < 0.05), 对照组小鼠死亡前骨髓有核细胞数上升不明显。本实验正常对照组骨髓有核细胞数为（8.76 ± 1.47) × 106/根股骨(n = 6)。移植后7 d观察X与Y染色体嵌合体数，实验1组为2/6, 实验2组5/6;移植后24 d实验1组为0/6, 实验2组3/6, 两组比较差异均有显著性，P < 0.05。
2.4 小鼠移植后骨髓CFU-GM的变化（图 2)对照组小鼠死亡前骨髓CFU-GM数上升不明显; 实验2组CFU-GM数在移植后4 d骨髓CFU-GM数分别是对照组和实验1组的1.4倍和1.2倍（P < 0.05), 实验2组CFU-GM数在移植后7 d骨髓CFU-GM数分别是对照组和实验1组的2.0倍和1.4倍（P < 0.01), 在移植后12、24d骨髓CFU-GM数分别是实验1组的2.2、2.3倍（P < 0.01)。
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图 2 各组小鼠移植后骨髓CFU-GM的变化 |
对照组小鼠未见CFU-S形成，实验2组的CFU-S数为55.8±12.6, 明显高于实验1组的6.22 ± 4.8 (P < 0.01)。在形态上, 实验2组小鼠的CFU-S比实验1组的CFU-S要粗大。
3 讨论机体受到致死量照射后，常因造血功能极度衰竭并发感染及出血而死亡，及时进行造血干细胞移植以恢复和重建骨髓造血功能，是最有效的救治手段。外周血干细胞移植因其具有采集细胞方便，供者无痛苦以及移植后造血和免疫重建快等优点，正被临床广泛接受，已有替代骨髓移植之趋势[4]。正常情况下PBSC的数量通常很低[1], 如小鼠的PBSC数仅为骨髓造血干细胞的1/50 ~ 1/100, CD34+造血干细胞含量仅为外周血单个核细胞的0.01%~0.1%，远远不能满足造血干细胞移植时所需数量, 因此需要应用动员剂使骨髓中的造血干细胞迁徙出髓进入外周血循环。
目前临床上广为应用的造血细胞动员剂是rhG-CSF, 其体内注射存在许多不足之处，如:所需时间长、剂量大、费用高，一般患者难以承受; 需定时监测PBSC的数量; 异基因移植时, 因大剂量rhG-CSF注射可引起剧烈骨骼疼痛, 健康供者不愿接受; 另外，临床上部分病例对G-CSF并无良好反应[5]。上述原因给外周血干细胞移植的广泛开展带来了一定的困难。所以寻找新的PBSC动员剂成为造血干细胞移植领域的热点问题之一。
近年研究表明，正常造血干细胞表面表达多种粘附分子，而骨髓基质细胞则表达这些粘附分子的配基，它们之间相互粘附作用使造血干细胞定位于骨髓增殖、成熟。VLA-4是介导造血干细胞与骨髓粘附最重要的粘附分子，参与了动员中骨髓造血干细胞的重新分布和归巢过程[6]。动物实验发现经rhG-CSF动员后造血干细胞表面VLA-4等表达显著下降，粘附能力也显著下降，从而认为粘附分子的表达下调使这种相互粘附作用被打破而介导干细胞的迁徙和出髓[7]。Craddock等[2]用抗VLA-4单克隆抗体连续给小鼠皮下注射3 d后发现，小鼠PBSC数增加近250倍; 进一步研究发现此方法动员出的PBSC移植给受致死剂量照射的14只同系小鼠，受体存活时间全部大于30 d，而在接受磷酸盐缓冲液处理小鼠PBSC的14只受致死剂量放疗的小鼠中，只有2只存活时间超过30 d，而未接受任何PBSC移植的14只受致死剂量放疗的小鼠30 d内全部死亡。
我们以往的研究(另文报道）显示抗VLA-4单克隆抗体可有效动员造血干细胞进入外周血，其作用特点是:①为粘附分子抗体，而基本上不刺激造血增生。②高效:使PBSC数增加27倍左右; ③可重复性好，其动员作用的时间稳定。这些优点恰好与目前临床广泛应用的rhG-CSF互补。抗VIA-4单克隆抗体动员PUSC的机制尚不清楚，结合文献推测其机制可能为:抗VLA-4单克隆抗体阻断造血干细胞表面VLA-4与骨髓基质细胞配基间的相互作用，使造血干细胞表面VLA-4表达显著下降, 使得相互粘附力下降或消失，促使造血干细胞出骨髓迁徙并进入外周血。而基因敲除G-CSF受体的小鼠的数据证实，用rhG-CSF动员时G-CSF受体的存在是必须的，而C-CSF受体表达却不是抗VLA-4动员造血干细胞所必需，抗VIA-4动员主要依靠可溶性C-kit受体[8]。
本研究表明，与生理盐水组相比，抗VLA-4单克隆抗体动员的外周血单个核细胞移植给受致死量照射的小鼠, 可增加骨髓有核细胞数，使CFU-GM、CFU-S产率增加，加速WBC恢复，缩短WBC恢复到正常水平的时间，将受照小鼠23 d存活率提高到70.8%, 与Christ等[9]的报道一致; X、Y染色体嵌合体检测证实，小鼠的造血重建细胞来自雄性供体。本研究中实验1、2组输注的外周血单个核细胞数相同，但受体鼠在存活率和造血重建能力上有差别, 进一步证实抗VLA-4单克隆抗体动员的外周血单个核细胞中富含造血干细胞。
本研究初步观察到抗VLA-4单克隆抗体动员出的PBSC可成功救治辐射损伤小鼠，有关抗VLA-4单克隆抗体联合rhG-CSF动员出的PBSC救治辐射损伤小鼠我们将进一步探讨。
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