核辐射事故和放射性治疗的主要晚期并发症之一是组织器官的纤维化, 它们的共同病理特征为功能细胞数量减少、纤维增生和膜增厚, 其物质基础是细胞外基质成分的异常积累。近年来, 在单次和多次大剂量γ射线和X射线照射对细胞外基质影响的研究方面进行了比较全面和深入的探讨, 基本了解了此类射线引发细胞外基质改变的规律和机制。但是, 对中子辐射生物效应的研究相对较少。目前, 尚不了解中子辐射对细胞外基质的代谢、积累、结构重建等会产生什么样的作用, 有必要对中子照射细胞外基质成分的效应加以研究, 为相关损伤的防治提供依据[1]。
1 实验材料与方法 1.1 实验材料透明质酸、层粘连蛋白、四型胶原和三型前胶原放射免疫分析试剂盒均由海研医学生物技术中心提供。匀浆缓冲液(0.05 mol/L PB, 1.0 mol/L NaCl, 2.0 mmol/L EDTANa2, 0.05% Tween-20, 0.05% NaN3, pH 7.0)自己配制。中子源为252Cf点源, 平均能量为2.438 MeV。雄性Wistar大鼠120只, 体重(170 ±10) g, 随机分为4个组:对照组、低剂量组、中剂量组和高剂量组。匀浆器为HP-800(美国), 智能放免γ测定仪SN-695-B(上海)。
1.2 实验方法高、中、低3组大鼠均放置在球形等距离(0.5 m)照射架上进行全身照射, 平均吸收剂量率为1.25 × 10-3 Gy/h, 每天平均受到的累积吸收剂量为1.92×10-2 Gy, 至照射结束时累积总吸收剂量分别为1.20、0.62和0.29 Gy。分别于照射结束后第3天、1个月和2个月时, 每组各取8~ 10只大鼠处死, 立即取出肺脏, 置冰块中预冷, 然后放在-30 ℃冰箱内冻存。检测前剪取200 ~ 300 mg肺组织, 先在蒸馏水中快速漂洗, 去除血迹, 用普通滤纸吸干表面水分, 放入6.0 cm ×1.2 cm的塑料试管内, 按1.0 ml/100 mg肺组织加入匀浆缓冲液。先冰水预冷5 min, 然后以13 000 r/min高速匀浆10 s。匀浆混合物置2 ~ 6 ℃冰箱内24 h, 2 360 g离心20 min, 取上清待测。透明质酸、层粘连蛋白、四型胶原和三型前胶原含量测定均按试剂盒使用说明书进行。但用于透明质酸、层粘连蛋白和三型前胶原测定的上清液均需用试剂盒零标准液做等比稀释。
1.3 数据处理各指标组间先利用excel中的方差分析工具进行方差分析, 组间差异显著者, 再进行两样本均数的t检验。
2 实验结果 2.1 肺组织透明质酸检测结果大鼠经中子照射后, 肺组织透明质酸含量在不同照射剂量组间和同剂量组照射后不同时间点之间差异均无显著性(方差分析, P =0.35), 但个体之间的差异较大(见表 1)。
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表 1 中子照射后肺组织透明质酸含量(x ±s) μg/L |
在照射后第3 d, 低、中、高剂量组与对照组相比3组肺组织层粘连蛋白含量均出现显著性变化, 经样本均数t检验(1.96、2.97和2.05), P值分别小于0.05、0.01和0.05。照射后2个月内, 低剂量组层粘连蛋白含量逐渐降低, 中高剂量组均逐渐恢复到对照组水平, 见图 1。
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图 1 中子照射大鼠肺组织层粘连蛋白含量变化 |
在照射后3 d、1 m和2 m的检测中, 中、高剂量组大鼠肺组织四型胶原含量与对照组相比均有升高的趋势, 但是, 只有高剂量组的变化具有统计学意义(t = 4.61, P = 0.0002), 见图 2。
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图 2 中子照射后大鼠肺组织四型胶原含量 |
大鼠肺组织三型前胶原含量不仅与中子照射剂量关系密切, 而且受到不同剂量中子照射后在不同时间的效应也不尽一致, 见图 3。
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图 3 中子照射后大鼠肺组织三型胶原含量变化 |
中子照射属于高LET辐射, 故在相同剂量下所产生的生物损伤效应比γ射线、X射线更强, 但是效应特征相似[1]。大鼠在不同累积中子照射剂量后各剂量组间肺组织透明质酸含量的变化差异无显著性。这与Rodeman等[2]采用γ射线照射大鼠全胸后所得到的观察结果基本一致。
照射后胶原成分的变化并不一定遵从剂量依赖性效应规律。Rosenbaum等[3]用X射线照射小鼠后14 d, 5 Gy组肺组织Ⅰ/Ⅲ型胶原mRNA的比例升高, 而12.5 Gy组肺组织Ⅰ/Ⅲ比例则降低。大鼠经中子照射后, 肺组织四型胶原和三型前胶原的剂量效应和恢复规律也存在类似的剂量效应背离现象。层粘连蛋白是主要的基质成分之一, 其功能是锚定细胞, 限制迁移[4], 虽不属于胶原蛋白, 但是其中子效应规律与胶原蛋白类似。
大鼠肺组织细胞外基质含量在中子照射后表现出的复杂变化现象, 反映出其代谢与调节过程的复杂性。基质成分含量降低不仅可能是因为合成减少, 同时也可能存在相关水解酶活性的升高[5]。基质成分含量增加则可能是因为合成增加或降解减少。波浪形修复现象可能与早期的应激效应和修复过程中的反馈调节环路机理有关[6]。
总之, 中子照射引起肺组织细胞外基质成分含量的变化可能以不同的程度向不同的方向发展, 或恢复照射前水平, 或过量修复超过照射前水平, 或缺失修复能力渐行走低。整个修复过程十分复杂, 不仅与照射剂量有关, 而且还与照后时间有关。所以, 在分析评价中子照射对细胞外基质的损伤程度和修复能力时, 不能简单地依据剂量效应关系来推测。
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Rosenbaum D, Peric S, Holecek M, et al. Hyaluronan in radiation-induced lung diseases in the rat[J]. Radiat Res, 1997, 147(5): 585-591. DOI:10.2307/3579625 |
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