转化生长因子β(transforming growth factor beta, TGF-β)最初(1978)从小鼠肉瘤病毒转化的3T3细胞无血清培养液中分离得到, 因其能刺激正常成纤维细胞不贴壁生长(转化), 而得名。随着对TGF-β研究的不断深入, 逐渐发现TGF-β是一类具有多种生理功能的多肽细胞因子, 可调节细胞生长、分化及蛋白合成。且与某些病理发生发展有关, 参与损伤修复的全过程, 包括炎症反应及细胞外基质的重建。近年来的研究表明TGF -β与电离辐射所致的以细胞外基质为基础的病理形成密切相关。
1 TGF-β的基本生物学特性人类TGF-β分为三型, 即TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3。它们的基因分别定位于19q13.1~q13.3、1q41和14q23~q24。TGF-β1、TGF-β3基因均有7个外显子, mRNA分别为2.4kb和3.5kb。首先合成一个无活性的TGF-β大分子(潜活TGF- β), 含390~414个氨基酸, 包括信号肽段、活性肽段及潜活相关肽段(latency associated peptide, LAP)。此大分子被分泌到胞外后, 信号肽和潜活相关肽分别与TGF-β活性肽段裂解分离, 释放出由112个氨基酸组成分子量为12 500的多肽。后者通过二硫键连结成有活性的分子量为25 000的同源二聚体。该二聚体迅速与LAP以非共价键结合, 后者再以二硫键与TGF -β结合蛋白(latent TGF-β binding protein, LTBP)形成更大的潜活复合物, 然后被储存在血小板α颗粒中[1]。
每个成熟TGF-β的单体均有高度保守的7~9个半胱氨酸残基, 其中6~8个互相靠近形成链内二硫键, 几个β片层肽段相互作用形成刚性结构, 使TGF-β具有耐热、耐酸碱和耐变性剂的特性。最后一个半胱氨酸残基形成链间二硫键将两条单体连结成具有生物学活性的同源二聚体。
TGF-β1的生物活性受控于TGF-β1潜活复合物的分泌及TGF-β1在胞外的活化过程。LAP在复合物中除了能使TGF-β保持无活性状态外, 还可使TGF-β正确折叠和顺利分泌。LTBP则可将TGF-β锚定在细胞外基质上。
当受到创伤、炎症以及酸、碱、蛋白酶等作用后, TGF-β从潜活复合物中释放出, 发挥其生物学活性。活化后的TGF-β部分作用于靶细胞, 部分与细胞外液中的大分子物质结合。但结合状态有所不同, 如与血清中的α2巨球蛋白结合失去活性, 与纤连蛋白结合则形成活性复合物。
机体的大部分细胞都能合成TGF-β, 尤其是激活后的内皮细胞、巨噬细胞、肝星形细胞等可大量合成TGF-β。TGF- βmRNA表达的程度与细胞有丝分裂能力相关, 在转化细胞中的表达高于未转化细胞。血浆中已激活的TGF-β形成的复合物可被肝细胞上的受体(M6PR)摄取, 被蛋白酶降解。
2 TGF-β对电离辐射的直接效应雄性SD大鼠肝脏受到5.0 Gy γ射线一次照射, 照后肝TGF-β1 mRNA水平逐渐升高, 第4周达到照前的3.6倍。TGF -β3 mRNA水平在照后1周即达到峰值, 为照前4.8倍, 随后逐渐降低。照后第4周, 肝中央静脉周围TGF-β1蛋白含量增加, 并且主要出现在非肝细胞中[2]。
雄性Wistar大鼠经30 Gy γ射线一次性照射后第13~27周(纤维增生期)肺组织TGF-β1表达增加最显著。肾小球细胞(mesangial cell)受到5~20 Gy γ射线照射, TGF-β mRNA在照后24~48 h表现出非剂量依赖性增高; TGF-β3 mRNA在同期则出现进行性非剂量依赖性减少, 降至对照组的25%[3]。上述实验结果提示TGF-β1可能为正向调节剂, 而TGF-β3则可能为负向调节剂。
进一步的研究发现, 在蛋白质水平上大鼠皮肤损伤后1 h TGF-β1即迅速上升, 48 h后下降, 伤后第7天又出现第二个高峰; TGF-β2在伤后8 h增高, 72 h后下降。在mRNA水平上, TGF-β1 mRNA在伤后24 h升高到正常的9倍, 此后数天保持升高状态; TGF-β2 mRNA直到伤后第5天开始升高到正常的4.5倍; TGF-β3 mRNA也是第5天后开始升高, 第7天达到正常的12.5倍。结果表明TGF-β蛋白水平与TGF-β mRNA水平在损伤后一段时间内存在背离现象, 可能是由于在TGF-β mRNA的表达与TGF-β蛋白的释放之间存在着TGF- β潜活复合物的形式, TGF-β mRNA的表达增强不一定马上出现TGF-β活性蛋白的增加, 而TGF-β活性蛋白增加可能是潜活复合物释放增多, 而非TGF-β mRNA即刻翻译的结果。小鼠乳腺即使经0.1 Gy γ射线照射也可检出TGF-β1的免疫活性升高, 同时伴随LAP降低, 并且在0.1~5.0 Gy范围内呈线性剂量相关。这进一步证实了上述推测的可能性。
C57BL小鼠全肺经13 Gy γ射线一次照射后36 h肺组织TGF-β1的表达下降, 2个月时TGF-β1表达升高, 8个月时又呈现下降趋势, 但仍高于正常水平, 此时肺纤维化病灶已经形成。TGF-β在辐射损伤组织中的水平呈现明显的波浪形变化, 这可能与其反馈性调节环路机制有关。
3 TGF-β在电离辐射基质效应中的作用细胞外基质主要由胶原蛋白、层粘连蛋白、纤连蛋白等组成, 它们在结构与量上的变化是各组织器官间质病理改变的基础。放射性损伤最常见的终末结果之一是组织器官的纤维化, 其主要的病理改变之一就是间质组成与结构的异常变化。
多种细胞因子与基质代谢有关, 且具有影响纤维化形成的作用, 如IL-1, IL-2, IL-4, PDGF, TGF-α, TGF-β和TNF-α等, 尤其是TGF-β1。激活后的TGF-β1可促进基质蛋白成分的合成、诱导纤溶酶原激活物抑制剂的转录、上调整合素基质粘合分子, 以及趋化成纤维细胞和单核细胞等[4]。
1.0 ng/ml和10.0 ng/ml浓度TGF-β1分别使传代培养的椎间盘髓核细胞Ⅰ型胶原mRNA增加1.48倍和2.03倍。在此浓度范围内, 也可以剂量依赖性模式促进Ⅲ型胶原mRNA的表达, 而且在6~48 h内Ⅲ型胶原mRNA的表达量与时间呈正比。这提示TGF-β1可能与椎间盘退变过程中的不断纤维化进程密切相关。
乳腺癌和肺癌患者胸部放射治疗常见的副作用之一是间质性肺炎最终发展为肺纤维化。肺纤维化的本质是机体对损伤产生的一种炎症应答反应, 是损伤过度愈合的结果。主要表现为肺泡壁中出现大量的肺泡巨噬细胞、成纤维细胞和胶原类细胞外基质成分[4]。巨噬细胞可大量表达TGF-β1 mRNA和IL-4。成纤维细胞、肌成纤维细胞和嗜酸性细胞也是肺内TGF-β1增加的主要来源。在炎症反应中, 活化的TGF-β1可刺激成纤维细胞合成Ⅰ、Ⅲ型胶原和纤连蛋白, 并可使成纤维细胞分化为肌成纤维细胞, 并表达多型胶原和α平滑肌肌动蛋白, 它们是肺纤维化的主要物质基础。此外, TGF-β1还可诱导肺组织高水平表达结缔组织生长因子(connective tissue growth factor, CTGF), 进一步增加其他基质成分的产生, 加速肺纤维化进程。
TGF-β诱导多种基质基因如Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ型胶原和纤连蛋白基因等表达的现象在纤维化肝组织中也存在[5]。如活动性肝纤维化病人, 肝内TGF-β1 mRNA的表达比对照组高2~ 14倍, 而且增高的TGF-β mRNA与Ⅰ型胶原mRNA的表达显著相关[6]。TGF-β的高表达主要出现在肝脏非实质细胞如贮脂细胞(Ito细胞)、成纤维细胞及枯否细胞(Kuffer)等。在野生型和TGF-β1-腺病毒导入的小鼠体内Ⅰ型胶原mRNA水平正比于TGF-β1 mRNA含量。肝表达TGF-β1的转基因小鼠表现出自发肝纤维化的趋势。在敲除TGF-β1基因的小鼠在同样条件下Ⅰ型胶原mRNA表达水平下降[7]。
小鼠经全身60Co γ射线照射后, 乳腺TGF-β1免疫反应性增加, 同时伴随TGF-β1前体的减少。这种免疫反应性的迅速转变是潜活TGF-β1原位活化的结果, 这种交互式转化可在照后持续3 d[7]。小鼠乳腺经0.1 Gy γ射线照射后即可检测到上皮细胞中TGF-β免疫活性增加的同时伴随LAP含量减少, 在0.1~5.0 Gy范围内存在剂量反应曲线。如果照射前注射抗TGF-β1单克隆抗体可抑制辐射诱导的Ⅲ型胶原mRNA的表达, 减少Ⅲ型胶原蛋白的合成, 且存在抗体剂量依赖关系[8]。这说明电离辐射能够导致潜活TGF-β活化, 继而作为电离辐射效应介质引发基质成分的改变[9]。
大鼠肾小球膜细胞受到γ射线照射后, TGF-β1 mRNA表达出现显著增高, 后者以剂量依赖性关系促进肾间质成纤维细胞增殖及其3H-脯氨酸掺入和Ⅲ型胶原mRNA表达[10]。肾间质纤维化的组织学特征为成纤维细胞大量增殖和细胞外基质的大量堆积, 此显示TGF-β1在肾间质纤维化中可能起重要作用。
正常肝组织中仅有极少或无TGF-β1分泌, 当肝脏受到电离辐射或病毒感染造成损伤后则使枯否细胞活化分泌多种细胞因子, 激活肝星形细胞等间质细胞分泌TGF-β1, 促进基质的合成和沉积, 导致肝纤维化的发生与发展。炎症刺激是促进TGF-β1分泌的原因, 肝纤维化加重则是TGF-β1作用的结果[11]。
4 TGF-β在电离辐射效应中的作用机制生物体是一种复杂的有机整体, 其中任何器官、组织、细胞或分子要发挥作用都需要其他相关部分的协调与配合。同样, 细胞因子发挥功能也离不开周围合适的微环境。这种微环境包括细胞外液、基质成分、细胞因子、可接触细胞界面等。TGF -β在适宜的微环境中发挥作用的过程可分为四个阶段:潜活TGF-β的活化、信息传递、效应实施和效应反馈。
巨噬细胞、淋巴细胞、肝星形细胞等合成的TGF-β前体大分子分泌到胞外, 与LAP结合蛋白结合后以潜活形式进入血小板α颗粒贮存或附着于基质分子上。当受到辐射、创伤或炎症刺激后局部组织细胞产生的蛋白酶、纤溶酶、活性氧或微循环变化等作用于潜活TGF-β复合物, 使其在RXXR位点裂解, 释放出成熟多肽, 进而形成活性TGF-β分子。
除了人视网膜母细胞瘤和鼠嗜铬细胞瘤外, 几乎所有人体正常细胞和转化细胞表面都表达一种或几种TGF-β受体(TGF-β receptor, TβR)。正常情况下, 每个细胞表面约有2 000 ~4 000个TβR。TβR分为两型:Ⅰ型和Ⅱ型。每个TβR分子都包含胞外的配体结合区、跨膜区和胞内的激酶区, 激酶区为丝/苏氨酸激酶。TGF-β首先与跨膜受体TβR-Ⅱ结合形成复合物, 此时TGF-β构型发生变化, 被TβR-Ⅰ所识别并与之结合形成TβR-Ⅱ-TGF-β-TβR-Ⅰ复合物。复合物中的TβT- Ⅱ将TβR-Ⅰ的GS区磷酸化。TβR-Ⅰ被磷酸化激活后, 信号即传入细胞内[12]。进一步使SMAD蛋白磷酸化形成二聚体, 并进入细胞核内, 与相关的转录调节蛋白结合, 这就是典型的TGF-β信号传递途径。
磷酸化的SMAD蛋白通过与不同的转录调节蛋白结合, 作用于相应基因, 达到启动、增强或抑制其表达的目的, 最终由表达产生的各种蛋白产物水平的变化引发各种生物效应。许多基质成分及细胞因子的表达受到TGF-β的调节, 如Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ及Ⅺ型胶原蛋白、IL-2R、Rb、C-myc、TIMP-1、P16INK4A、P15INK4B、P21wafl/cipl及P27kipl等等, 从而影响相关的生物效应[13]。
TGF-β不仅可在基因表达水平上发挥调控作用, 而且还可直接在细胞水平上发挥作用, 如抑制T、B淋巴细胞的活性和增殖, 抑制巨噬细胞的吞噬能力, 刺激间质细胞增殖, 趋化炎症细胞, 抑制正常及恶性上皮细胞增殖等等[14]。
TGF-β1在促进胶原蛋白、肌腱蛋白、纤连蛋白等细胞外基质成分及纤溶酶原激活物抑制剂、组织金属蛋白酶抑制剂等合成的同时, 抑制纤溶酶原、金属蛋白酶等基质降解类蛋白酶的合成。综合结果表现为细胞外基质成分的合成加强、降解减少和积累增加[15, 16]。
Spom认为许多细胞因子的表达与生物学效应均应从一个由其周围环境诸多因素相互作用组成的网络中来认识。在不同的环境, 不同的时间下可能会有截然不同的表现。所有的细胞因子都是存在于一个复杂的细胞因子网络内, 在其中发挥作用, 并受其制约和调控。整个网络保持一种动态平衡, 只有当外界因素破坏了这种平衡时, 某些细胞因子才能泛滥其作用, 造成病理性效应结果, TGF-β引发的各种病理现象也正如此。正常情况下, 抑制型SMAD的mRNA转录需要TGF-β1的启动。新合成的抑制型SMAD可与磷酸化的TβR-1形成高稳定性的复合物, 但并不被其磷酸化, 从而阻断TGF-β1信号的传递途径, 构成了完整的反馈调节环路。此外, 糖皮质激素、α2巨球蛋白、修饰素等均可与活化的TGF-β1结合, 隐蔽或灭活其活性。细胞外基质成分也可粘附活化的TGF-β1分子, 限制其流动扩散[17]。正由于这些控制环节的存在, 使得活化TGF -β1半衰期很短(小于5 min)。
5 结语尽管TGF-β具有多方面的作用, 但是在电离辐射效应中TGF-β的主要作用表现为对细胞外基质代谢的影响, 临床上则表现为促进器官或组织的纤维化。TGF-β对机体组织产生的损伤反应主要是由于它的自分泌、旁分泌和内分泌环路机制使其产生与作用的形式带有一定的封闭性, 作用过程则形成一种持续性、持久性和进行性的过程, 虽然TGF-β对组织器官纤维化并不起绝对的决定作用, 但是有利于严重后果的形成(组织器官的纤维化、硬化、结构破坏、功能丧失)。
目前, 组织器官纤维化仍为不可逆转的过程, 延缓其进展是唯一可采取的有效措施。纤维化可由慢性不良刺激、辐射损伤、感染及自身免疫病引发。目前, 治疗肺纤维化主要采用皮质类固醇激素, 其次是用细胞毒剂如环磷酰胺、秋水酰碱等减少不良刺激及反应。这些药物副作用大, 且效果并不理想。TGF-β1的中和抗体、无活性受体拮抗剂、可溶性受体、反义寡核苷酸等由于针对性强, 副作用小, 故是一类有希望的候选治疗剂[18]。大剂量照射后引起的间质性肺炎, 往往是病人死亡的重要原因之一, 目前尚无有效的治疗药物。病人即使侥幸度过炎症期, 仍然难逃之后的肺纤维化。TGF-β1活性抑制剂有可能成为防止此类病人死亡的希望所在。
总之, TGF-β是一种多效的细胞因子, 它的主要功能是参与和促进损伤的修复和基质重建。由于其自身的分泌和调节机制特点, 往往造成效应的持久延续和扩大, 引起病理性结果。但是, TGF-β在纤维化病理形成中的颈位作用, 为组织器官纤维化的防治研究指明了方向, 使相关措施和药物的开发能够有的放矢。
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