1962年Bender首次提出用染色体畸变分析法来进行事故剂量估算, 随后大量的研究表明, 离体照射哺乳动物外周血诱发的淋巴细胞染色体畸变量与活体照射所得的剂量-效应曲线二者统计学上相一致。迄今, 染色体畸变分析已作为一种可靠的、灵敏的生物剂量计得到广泛应用。染色体畸变分稳定性畸变与非稳定性畸变两种, 非稳定性畸变主要以分析双着丝粒+环来估算事故剂量, 由于随着时间的推延和分裂次数的增加而逐渐减少, 不适于回顾性剂量或累积剂量的估算。而稳定性畸变(如易位、倒位、缺失), 通过细胞周期, 在照后长期保持恒定, 所以能满足估算慢性照射剂量和剂量重建的要求。以往用传统的常规染色和显带技术分析易位, 要求技术高, 而且费时, 难以推广。Pinkle等于1986年首先应用FISH技术检测染色体重排, 随后经十多年的研究、改进, 发现它能准确、迅速的检测易位, 有可能成为估算职业受照人员累积剂量及早先受照者剂量重建的理想手段。

1 荧光原位杂交简介

荧光原位杂交是根据DNA碱基配对原则, 用互补有标记的DNA探针进行定位杂交。标记DNA探针常用地高辛或生物素, 可与相应的特异性抗体结合, 经荧光素(FITC)标记的特异性抗体在荧光显微镜下, 可清晰的描绘出与DNA靶结合部位。FISH技术主要包括5个过程:(1)制备和标记探针; (2)染色体标本的制备; (3)原位杂交; (4)信号处理; (5)观察计数。目前FISH方法学的研究正在不断的发展。例如分别用生物素、地高辛/荧光素组合探针进行双色或多色荧光原位杂交, 可以一次检测多条染色体的畸变。由于其具有操作安全、检测范围广且迅速方便、高度敏感及特异性等特点, 而一直受到人们极大的关注。

2 FISH技术与体外剂量效应关系曲线的建立

近年来已有许多有关FISH技术进行辐射剂量效应关系研究的报道。FISH技术最主要的方法学优势在于既可测定不稳定性染色体畸变, 也能取代常规染色体分带的方法测定稳定染色体畸变, 因为在理论上, 一般认为照后第一次分裂中期细胞中染色体双着丝粒和易位出现概率是相同的, 它们是两个或多个染色体出现缺失的结果。常规细胞学方法分析双着丝粒的准确性已为人们所认可, 用FISH技术分析的全基因组的染色体双着丝粒的准确性也逐渐为人们所接受。但是使用哪种类型染色体畸变作为剂量效应观察指标, 有着不同看法, 是选用完全性易位、不完全性易位, 还是全部易位, 尚存争议。

Stephan等^[1]采用2、4、8全染色体探针组和着丝粒探针分析250kVX射线诱发的染色体畸变, 忽略畸变自发率, 总易位率与双着丝率之比为1.13。原则上每剂量单位对称易位率与非对称易位率是相等的, 因两者均由染色体双链断裂引起。以往常规显带法结果与之相符。然而, 近年来用FISH法所得两者之间的比例并不相等。徐永忠等^[2]用1、4号染色体探针FISH法分析所得结果为:辐射诱发染色体易位率约为双着丝体率的1.23倍, 而常规法比FISH法检测到的双着丝体率略高。Lindholm等^[3]分别用1、2、4号全染色体探针FISH技术与常规细胞遗传学方法分析染色体畸变率, 在各剂量点, 两种方法所得双着丝体率和易位率一致, 常规分析双着丝粒得到的剂量效应曲线要好于FISH法分析易位率所得剂量效应曲线, 这可能是由于计数标准的不同。作者进一步证明, 总易位率作为剂量效应观察指标的可靠性很小, 而完全性易位较为可靠。Barquinero JF^[4]等用1、4、11号染色体探针和全着丝粒探针, 180 kVX线照射离体外周血, 建立剂量效应关系曲线。分别用PAINT和常规细胞遗传学分类法计数染色体畸变, 结果两种方法所得双着丝粒效应曲线和剂量估算一致; 易位的自发率高于双着丝粒, 这影响了二者之间在低剂量点的比率, 也影响了易位率的剂量效应曲线与剂量的一致性。Bothwell AM^[5]等使用1、3、4号全染色体探针和全着丝粒探针做了类似研究, 结果表明FISH技术分析染色体畸变PAINT分类法计数所得易位率与双着丝体率非常一致, 且用FISH分析全部易位、双着丝粒与常规分析双着丝粒得到的剂量效应关系完全相同。且均符合线性平方模式。Moquet JF^[6]等用2、3、5全染色体探针和全着丝粒探针的FISH技术研究了X、γ和裂变中子诱发染色体畸变的剂量效应关系, 结果表明:每种射线诱发靶染色体易位和双着丝粒之比平均为1.5, 并且双着丝粒和易位出现是相关的, 完全性易位与总易位之比为0.6~0.7, 该值随剂量的增高而减少(< 0.5 Gy), 表明复杂染色体畸变随剂量增高而增多, 而染色体复杂畸变增多, 不完全性易位也增多, 后者与其他染色体重排有关。Finnon J.E.等^[7]用2、3、5全染色体组合探针和泛着丝粒探针⁶⁰Co γ射线离体照射引起的人外周血淋巴细胞染色体畸变率, 易位率与双着丝率之比为1.21。两者所得剂量效应曲线均符合线性平方模式; 由于复杂畸变而引起双着丝与易位的分布具有相关性; 靶染色体的互换率与其长度成正比。Palafs^[8]等用2、3、5探针和全着丝粒探针分析双着丝率与易位率, 将淋巴细胞培养时间延长到72h, 了解M₁和M₂期细胞染色体双着丝与易位的持续情况。实验表明M₂期双着丝粒率与简单的单向(末端)易位率均下降, 尤其在低剂量点时, 下降更为明显; 双向(相互)易位是稳定的。作者建议用双向易位(完全性易位)作为生物剂量评估的指标。以上研究说明, 染色体畸变能否在细胞内长期保存, 是作为剂量效应指标的首要前提。现在还不清楚是易位染色体确实多于双着丝粒染色体, 还是其他因素的影响, 如染色体探针的选择、易位染色体的识别标准, 复杂畸变对于易位率的影响。对此类问题需要进一步研究, 有助于染色体畸变形成机制的揭示。

3 FISH技术检测染色体复杂畸变

以往应用常规染色或显带方法, 只能检出二条染色体间的简单易位和部分复杂畸变, 自FISH技术应用以来, 发现辐射诱发的染色体畸变远比过去想象的复杂, 尤其在低LET射线高剂量或高LET射线照射情况下, 严重影响检测结果。复杂畸变是指在二条或多于二条染色体间发生3个或3个以上断裂点的重排形成的畸变。Simpson等^[9]用250 kVp X射线照射人纤维原代细胞进行研究, 剂量2、4、6 Gy, 用全染色体探针1、4、5、7、13号和全着丝粒探针, 发现4 Gy时, 有20%互换为复杂型, 而且复杂畸变随剂量增加而增加。复杂畸变涉及的染色体3个以上者, 2 Gy时有75%, 4 Gy时有100%, 6 Gy时在100%中有50%是涉及4个染色体间5个断裂。作者认为, 在大剂量照射时, 由于细胞受损较重, 用直接检测复杂畸变要比实际低得多。Finnon J.E等^[7]用2、3、5全染色体组合探针和泛着丝粒探针研究⁶⁰Co γ射线离体照射引起的人外周血淋巴细胞染色体畸变率, 剂量为1 Gy, 复杂畸变率占总畸变的2%, 剂量为4 Gy, 占16%。作者在1995年^[10]所做的同类研究得出的结果是:0.5 Gy时占4%, 4 Gy时占13%, 而且复杂畸变随剂量的增加而增加。应用PAINT标准计数畸变的结果表明, 易位率出现严重的过度分散, 在统计学上有很大的不确定性, 不适用于回顾性剂量的评估。Lindholm^[11]等进行了同类研究, 认为染色体复杂畸变是不稳定的, 在回顾性剂量估算时只能用完全性易位作为FISH分析的指标。Anderson RM^[12]用全染色体探针1、2、5与全着丝粒探针结合DAPI复染进行染色体彩涂。高LET α射线(121 keV)0.5 Gy与低LET X射线(250 kV)3 Gy所产生的复杂畸变分别占总互换率的49%~56%、20%~22%;α电离粒子诱发的复杂畸变高于低LET X射线, 低LET辐射诱发的染色体复杂畸变随剂量增加而增加; 损伤细胞由第一次分裂到第二次分裂的迅速减少, 说明损伤细胞在不断死亡。为更加清楚地识别染色体复杂的结构畸变, K.M.Greulich^[13]用FISH技术分析3 Gy光子离体照射人外周血诱发的染色体畸变类型, 结果70%的畸变中, 两条染色体间发生互换的占37.2%, 而在3~9条染色体间发生重排的占52.3%, 涉及10~15条染色体间的复杂畸变占1.3%。作者同时用该法分析了在1986年切尔诺贝利事故中, 受照剂量为5.4 Sv、受照9 a之后的1名受照者造血祖细胞, 发现两个含有染色体复杂畸变的细胞克隆, 这说明复杂畸变在体内保持长期恒定。

4 用FISH技术对早先受照者的剂量估算和验证

因为稳定性染色体畸变能顺利通过细胞分裂而不导致细胞死亡, 所以利用它对早先受照者和无物理剂量资料的人员作回顾性剂量估算。FISH技术、常规细胞遗传学方法和物理学方法进行比较可进一步证明估算剂量的正确性。Salassidick等^[14]采用1、4、12号全染色体探针和泛着丝粒探针对切尔诺贝利事故中12例受照者进行回顾性研究, 12例当中的11例在随访的3年间(1991~1994), 易位率相当恒定。受照5 a后FISH法所得剂量结果与常规细胞遗传法所得剂量结果相似, 说明易位是一个稳定性染色体重排, 在体内保持长期不变, 反映最初染色体损伤; 其中一名受检者体内发现染色体畸变的细胞克隆, 占分析细胞的5.5%~9%, 对总易位率的计数影响很大。Stephan A^[1]等用2、4、8全染色体探针和全着丝立探针对3名11 a前核事故受照者染色体畸变进行了分析, 结果3人平均易位率为13.4/1000个细胞, 且75%为完全性易位, 受照当时常规遗传学法双着丝粒率为(7.8~10)/1000个细胞, 两者无明显差别。Snigiryova G^[15]等对52例去除污染工作人员用FISH方法进行的分析结果表明, 易位率均值为(1.2 ±0.16)/100个细胞, 明显高于对照组, 其中35例具有记载剂量为(0.26 ± 0.03) Sv, 与用FISH法推算的平均生物估算剂量0.25 Sv非常吻合。另用常规遗传学方法和FISH方法对双着丝粒和易位率进行测定, 结果表明两种方法没有差别。Lloyd^[16]等对一位女性吸入氚水发生内照射的累积量进行了回顾性研究, 分别于事故后6 a和11 a在LINL (Lawrence Livermore National Laboratory)和NRPB (National Radiological Protection Board)两个权威实验室, 同时用不同探针组FISH技术进行研究, 估算的剂量分别为(0.68±0.12) Gy和(0.76 ±0.12) Gy, 数值基本一致, 并且与受照当时估算的结果非常吻合, 说明易位是非常稳定的。张泽云等^[17]采用2号全染色体探针FISH技术研究了钴源事故受照者外周血淋巴细胞的染色体畸变, 5例受照者曾在照后24h取外周血所测生物剂量为(1.9~5.1) Gy, 照后8、9 a用FISH技术随访观察所得易位率和总畸变率与最初受照剂量相关良好。王知权等^[18]采用FISH法分析了35名X射线工作者的染色体畸变率, 结果表明:稳定性畸变占主要份额, 其中相互易位占明显优势。由此可以看出早期电离辐射引起的染色体损害在体内基本保持不变, 用FISH技术可精确估算受照剂量。

5 结束语

FISH技术由于能快速、灵敏的检测染色体畸变, 已成为细胞遗传学研究中的重要工具。在对早期受照者的剂量估算方面取得一定进展。新近发展起来的mFISH (multicolor FISH)更有利于染色体复杂畸变的深入研究, 但使得判断复杂畸变存在一定的难度。Tucker^[19]等提出的染色体畸变识别和命名标准PAINT (Protocol for aberration identification and nomenelature terminology)用来命名FISH技术检测畸变时出现的各种类型畸变。而Finnon^[7]等认为这种方法计数畸变结果表明:易位率出现过度分散, 不符合泊松分布, 认为PAINT标准仍欠完善, 各种畸变的识别标准仍将进行深入研究。随着FISH技术的不断发展, 今后有可能要重新考虑命名体系。关于辐射诱发的染色体畸变与其DNA含量或物理长度是否呈正比, 目前存在两种观点。一种认为, 辐射诱发的畸变断裂点在整个基因线组中随机分布, 且染色体间发生交换的概率相等, 即每条染色体发生的易位或双着丝粒体与其DNA含量或物理长度呈正比。Kovacs Cigarran^{[20, 21]}等的研究结果支持这种观点。而Finnon^[7]等实验结果表明相反的观点, 即断裂点在染色体间的分布是非随机的, 大染色体比小染色体对辐射诱发染色体断裂更敏感。研究者在许多问题上尚存在争议, 虽然FISH技术有不少不足之处, 但随着实验水平的进步将逐步改进, 其应用前景也会更加广阔。