细胞程序性死亡(Apoptosis，Programmed Cell Death，PCD)是细胞的不同于坏死的另一种死亡方式，其特点为细胞发生核固缩、核碎裂和凋亡小体形成。PCD受诸多因素调控，P53是重要因素之一，其主要作用机制为触发异常细胞的凋亡过程^{[1, 2]}。曾有学者报道高剂量X射线照射可诱发细胞P53基因发生突变^[3]。本文旨在经介入放射检查及治疗病人的X射线常剂量来处理人外周血细胞，考察细胞的P53基因变异以及细胞凋亡状况，探索评价其工作中该剂量的安全性。

1 材料与方法 1.1 细胞

血细胞取自5位健康志愿者外周血，经淋巴细胞分离液密度梯度离心(400g×30 min)分离单核淋巴细胞，以Hank’s液洗涤离心2次，细胞再悬于RPMI 1640细胞培养液[含15%小牛血清、2 mmol·L^-1L-谷氨酰胺、1.5 mg·L^-1PHA(sigma)、10万U·L^-1青霉素和100mg·L-¹链霉素]。细胞浓度调节为1×10⁶个ml^-1。在X射线处理前，细胞经37℃孵育30 min。

1.2 仪器

用日本岛津RS-100型800 mA X射线机进行照射，管电压85kV，电流1.6mA，X射线焦点与标本距离为82 cm即焦皮距82 cm),用英国NE公司制造的法玛剂量仪2571型进行受照剂量监测，结果为1.1 cGy·min^-1。

1.3 X射线处理

样本共分7组，X射线照射剂量分别为200, 100, 50, 20, 10至5 cGy，以及空白对照。血细胞经X射线处理后，置37℃培养至96h。

1.4 细胞DNA提取

血细胞DNA的提取采用蛋白酶K消化，常规酚/氯仿抽提法抽提，乙醇沉淀后溶于TE缓冲液备用。

1.5 CR-SSCP银染技术检测P53基因5~9外显子突变

按Matozaki等^[4]提供方法，以PCR扩增P53基因的5~9外显子，引物由中国科学院上海细胞研宄所合成。取PCR扩增产物5μl与20μl 4×变性载样缓冲液(含95℃甲酰胺)混匀，95℃变性5min后置冰浴。PAGE采用6%聚丙烯酰胺凝胶(含5%甘油)，电泳后作银染色。

1.6 PCR-RFLP技术检测P53基因249位密码子突变

上述PCR扩增产物10μl加Hae Ⅲ 10 U37℃酶切12 h，取酶产物作8% PAGE银染色，该PCR扩增产物有一Hae Ⅲ酶切位点，若249密码子未发生突变则产生39 bp和78bp两个片段。若249密码子有突变，则该酶切位点消失。

1.7 P53蛋白的免疫组化染色

血细胞经96 h培养作涂片，甲醇固定，以3%过氧化氢封闭阻断，滴加抗P53蛋白单克隆抗体(D0-1，DAK0公司)50μl·片^-1，37℃孵育90 min后作SABC染色，DAB显色10 min，经苏木素复染，脱水，透明封片，显微镜下观察。

1.8 细胞凋亡的原位末端标记

细胞凋亡的检测，采用DNA末端转移酶介导的Bio-dUTP末端标记技术(Terminad De-oxynucleotidyl Transferase-Mediated dUTP-biotin Nick End Label-ing，TUNEL)，主要方法为:细胞涂片经甲醇固定，50μg·ml^-1蛋白酶K37℃消化15min，3%甲醇过氧化氢封闭，水洗后，滴加末端标记反应液50μl·片^-1，反应介质为:TDT缓冲液含100 mmol·L^-1 potassium Cacodylate, 2 mmol·L^-1 Cobalt Chloride, 0.2 mmol·L¹ dithiothteitol，pH7.2)，0.3 U·ul^-1TdT (Promage公司)和0.04 nmol·^-111-Bio-dUTP(华美公司）。经37℃标记90min后以0.02 mol·L^-1PBS中止和漂洗3次后作SABC染色(同上），DAB显色后，4%甲基绿复杂15 s，漂洗后脱水，透明封片，置显微镜下观察，每张片子取左、右、上、下、中5个不同部位，计数2 000个细胞，计算出细胞凋亡指数。

1.9 统计分析

实验数据的统计分析采用SPSS统计分析软件包处理。

2 结果 2.1 X射线处理对血细胞活性的影响

血细胞经不同剂量的X射线照射后，以苔盼蓝染色计数细胞存活率(见图 1)。

2.2 X射线诱导血细胞的细胞凋亡

血细胞以TUNEL技术测定细胞凋亡率，结果发现，未加X射线处理的血细胞自发细胞凋亡发生频率为(0.3±0.1)%, 且随着培养时间的延长而增长，至96 h, 凋亡频率约为(11.8±1.2)%, 而经不同的剂量的X射线照射24 h后，细胞凋亡频率与X射线剂量呈明显的剂量依赖关系(见图 2)。结果显示，X射线剂量>50 cGy在48 h后，细胞凋亡率与对照差异明显（P < 0.01)。20cGy在72h后与对照差异有显著性（P < 0.01)而5~10 cGy则与对照差异无显著性（P > 0.05)。

2.3 血细胞X射线处理后的P53蛋白的过度表达

血细胞经不同剂量的X射线处理、培养96 h后，作细胞涂片，P53蛋白的免疫组化染色结果各剂量组均未检测到异常表达的P53蛋白。

2.4 血细胞的P53基因5；9外显子的PCR-SSCP分析

血细胞经X射线处理，培养96 h后，取细胞DNA, 作PCR扩增，扩增产物经SSCP-银染分析。结果P53基因5~9外显子未出现单链DNA泳动变位(mobility Shift), 经0~200 cGy剂量X射线处理后P53基因的5~9外显子未出现明显的突变。

2.5 血细胞的P53基因249位点的PCR-RFLP分析

为进一步观察血细胞P53基因的突变，以PCR-RFLP技术检测249密码子的突变，结果所有标本的P53基因249位密码子Hae Ⅲ酶切位点均未丢失，表明在0~200 cGy的X射线处理后血细胞未出现P53基因249密码子的急性突变。

3 讨论

医疗照射是人工电离辐射的主要来源，介入放射是医疗照射的重要组成部分，此法X射线曝光量大，曝光时间长，介入放射是否造成对P53抑癌基因的影响，目前这方面的报道甚少。

X射线对人体细胞的影响是多方面的，主要危害之一为诱导细胞转化，而促使细胞转化有诸多因素，其中最主要为P53基因的异常, 正常的P53基因产物通过诱导细胞程序性死亡，清除异常细胞，维护机体平衡，1993年Krolewski和John^[3]等学者报道经X射线诱导转化的体细胞存在有P53基因异常，认为X射线通过促使P53基因突变导致细胞转化。为考察X射线对人体细胞的影响，选用常用临床剂量5~100 cGy以及较高剂量200 cGy对人外周围血淋巴细胞的P53基因、P53蛋白的表达以及细胞凋亡的影响，以期探讨临床介入放射的安全性。

P53基因在X射线诱导细胞转化中的作用，由于实验方法的不同所得结果有所差异，Krolewski等米用每天600 cGy连续6周的处理结果诱导成3株转化细胞，进一步分析3株细胞的P53基因，蛋白以及细胞凋亡，认为X射线诱导转化细胞的成功，主要是通过X线诱使P53基因突变而导致细胞的转化，而Yanagish^[6]等通过野生型P53基因传染细胞后以X射线诱导，结果发现通过野生型P53基因的转染能明显降低细胞转化和突变，认为野生型P53蛋白修复经X射线损伤的细胞基因，维持细胞基因的稳定性。

本文利用介入放射常用剂量的X射线处理人外周血淋巴细胞，经培养96 h以PCR-SSCP技术测定细胞P53基因的5；9外显子变异，结果均未出现单链DNA的异常泳动，同时通过PCR-RFLP亦未发现P53基因突变热点249位密码子的突变。此外通过免疫组化染色，未检出P53蛋白的异常表达，实验过程中所设阳性对照均可检出P53基因和蛋白异常，实验结果表明我们所用的剂量的X射线处理血细胞以P53基因和蛋白为指标均无明显影响，细胞均为正常。表明5~200 cGy剂量的X射线，单剂量照射诱导细胞转化的可能性极小。

血细胞对X射线较为敏感, 经不同剂量的X射线处理后，细胞活性受到一定影响，且细胞存活率与X射线照射剂量有密切关系(见图 1)而细胞凋亡是细胞对X射线的正常反应，实验结果表明X射线处理后的细胞凋亡发生频率与X射线剂量相关，尤其在X射线处理48 h后X射线剂量> 50 cGy组细胞凋亡率与空白对照组差异明显。在72 h后20 cGy组与对照组的差异亦显著（P < 0.01)而剂量 < 10 cGy组差异则不显著，对照X射线处理后的细胞存活率，两者相关。实验结果与Boreharn结果相似^{[5, 8]}。结果表明临床常用剂量的X射线处理外周血淋巴细胞通过细胞凋亡清除损伤细胞，维持机体平衡。外周血淋巴细胞的细胞凋亡对X射线较为敏感，可作为人体反映X射线剂量的生物学指标和模型之一。