差异显示方法自问世以来就受到重视并得到广泛的应用。该方法是从差异表达的mRNA中分离基因片段, 首先从DNA序列凝胶中切下感兴趣的片段, 再进行PCR扩增、Norther印迹杂交和cDNA片段克隆。差显技术相对简单、灵敏度高、周期短, 能同时比较多种样品。但差异显示法也存在一个问题, 即在许多实验中都发现从序列凝胶中纯化的PCR产物存在序列不均一性。因此, 克隆插入尽管是希望的片段也频繁出现序列不均一性的现象, 我们在云锡矿工和高氡暴露地区居民肺癌相关基因研究的课题中也遇到同样的问题。为了解决这个问题, 作者使用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)的方法^{[1, 2]}, 用以鉴定正确的阳性克隆片段, 避免了假阳性带来的误差, 保证实验顺利进行。

1 实验方法 1.1 RNA提取

选自甘肃陇东地区有长期居住窑洞史的肺癌患者手术切除的正常肺和肺癌组织, 液氮储存运至实验室。先用TRLzol RNA试剂盒提取肺癌和正常肺组织的RNA, 按常规方法检测RNA浓度和纯度。

1.2 反转录cDNA和PCR反应

RNA在反转录酶的作用下转录为cDNA, 逆转录反应的引物有3种: HT₁₁A/G/C, 随机引物共8种: HAp1 -8。3种逆转录产物分别与8种随机引物进行24次PCR扩增反应。

1.3 mRNA差异显示

用6%变性聚丙烯酰胺凝胶分离两种肺组织反转录cDNA的PCR产物, 用硝酸银法染色凝胶。

1.4 PCR扩增差显片段

用相应的引物扩增从DNA测序胶中切下的差异片段, 琼脂糖凝胶鉴定PCR产物的纯度并从低熔点凝胶中回收。

1.5 PCR片段克隆

按Promega公司PGEM-T Easy试剂盒提供的方法进行。

1.6 质粒DNA提取

每个克隆片段分别选5~10个白色菌落放入LB培养液过夜培养, 然后按wizard PCR preps DNA purification system的方法提取质粒DNA。

1.7 质粒DNA的扩增

在50 μL PCR反应体系中加T₇和SP₆引物0.8μL(12.5 μmol/ L), Taq酶0.1μ1(5U/μ1)。反应条件为94 ℃5 min, 94 ℃30 s, 55 ℃30 s, 72 ℃30 s, 30个循环, 最后延伸72 ℃7 min。

1.8 PCR-SSCP分析

取PCR产物15 μL加2倍体积的变性上样缓冲液(95 %甲酰胺, 20mmol/L EDTA pH8.0, 0.05 %二甲苯青, 0.05 %溴酚蓝)混匀, 98℃变性10 min。变性液放置冰上骤冷后立即上样进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。12%聚丙烯酰胺凝胶, 1×TBE(45 mmol/ L Tris-硼酸、1 mmol/ L EDTA)为电泳缓冲液, 100 V电压, 电泳5~6 h。取下凝胶进行硝酸银杂色: 10%乙醇10 min, 1%硝酸10 min, 12 mmol/ L硝酸银染色30 min, 3%Na₂CO₃-0.02%甲醛显影至条带清晰而背景不至过深时取出, 用10%乙酸定影5 min, 晾干, 摄影, 记录实验结果。

1.9 克隆产物进行基因测序分析

用ABI 390全自动DNA序列分析仪由赛百盛生物公司完成序列检测工作。

2 结果和讨论

编码1号差异片段的10个阳性克隆PCR-SSCP电泳结果显示, 10个样品电泳带的泳动位置相同。随意挑选2个进行基因测序分析, 碱基序列也相同。编码2和3号差异片段10个阳性克隆的PCR-SSCP电泳结果中有1或2个电泳带泳动位置不一致, 我们分别挑选出电泳带泳动位置相同和不同的样品进行基因测序, 结果显示电泳泳动位置相同的克隆片段, 基因序列也相同。电泳泳动位置不同的片段, 基因序列也不同, 有的片段基因序列仅差1个碱基。

一般实验室在鉴定插入克隆片段的正确性时多采用EcoRI限制性内切酶的方法^[3], 但无法保证cDNA的均一性, 尤其在酶切电泳中不能分辨只有1个碱基差异的基因片段。我们把PCR-SSCP的方法应用到鉴别差异片段正确阳性克隆的实验中, 获得很好的实验效果, 避免了假阳性克隆带来的麻烦。总之, PCR-SSCP的方法具有灵敏度高、重复性好的特点, 具有一定的使用价值。