微核测定被誉为染色体畸变快速测定方法, 自1976年Countryaman和Heddle^[1]公开发表了检查人淋巴细胞微核方法以来, 由于此法快速简便、易于掌握和操作, 并发现在培养条件下, 微核出现率与受照剂量呈线性正比关系, 提示可用来估算人的受照剂量。随着原子能和平利用的日益广泛, 医药、农药和化学工业的蓬勃发展, 对那些可疑有诱变活力并与人类关系密切的理化因素, 各种射线以及环境中其他诱变因子的监测乃是人们日趋关注的一个重要课题。我们于1976年开始建立了微核测定方法。24年来先后建立了4种微核测定方法, 在辐射损伤中作了较全面系统的应用研究。并对方法的应用价值作了评价, 今总结报告如下。

1 材料与方法 1.1 对象

① 正常值选用献血员和健康成人的静脉血。②接触各种射线的职业受照人员的静脉血。

1.2 方法 1.2.1 明胶法

取静脉血0.5~1 ml, 放入刻度离心管中, 立即搅拌去纤维蛋白, 加入血量1/3的3%明胶液(新鲜配制), 混匀, 置37 ℃恒温30 min(分离淋巴细胞), 取上清液于另一试管中, 2 000 r/min离心5 min, 弃上清液, 取沉淀物涂片, 瑞氏染色。每例观察2 000个淋巴细胞, 微核率用千分率(‰)表示。微核判断标准系游离于细胞浆中呈圆形或椭原形小核, 与主核完全分离, 嗜色性与主核一致, 为主核的1/3以下, 边缘光滑, 应与嗜天青颗粒、脱落的嗜酸颗粒及附着的血小板相鉴别。

1.2.2 甲基纤维素法(MC法)

采取静脉血0.5 ml, 置于盛有肝素抗凝的试管中, 按血量的1/2加入0.5%甲基纤维素, 充分混匀, 置37 ℃恒温箱中静止30 min, 离心10 min, 弃去上清液, 取沉淀物涂片, 瑞氏染色, 镜检。计数和判断微核标准同明胶法。

1.2.3 培养法

取静脉血0.3 ~0.5 ml, 加入含有RPMI1640、小牛血清、PHA和肝素组成的培养液中, 37 ℃恒温培养72 ~76 h, 按标准法制片, Gemsa染色。每例计数1 000 ~2 000个转化淋巴细胞, 微核判断标准同明胶法。

1.2.4 松胞素B法(CB法)

方法详见文献[2], 在培养液中加入0.5 ml血, 恒温培养至40 h加入松胞素B。先将松胞素B溶于二甲基亚砜中, 配成2 mg/ml的储藏液, -20 ℃保存, 用前融化, 生理盐水稀释, 在培养体系中的最终浓度为6 μg/ml, 避光培养到70 h收获。吸出上清液, 往沉淀物中加4 ml 0.075 mol/L KCl, 混匀后立即加新配的固定液4 ml, 混匀并移入离心管, 1 000 r/min离心10 min, 去上清液, 重复固定一次, 离心后取沉淀物涂片, Giemsa染色。阅片及微核判定标准同培养法。

2 结果与分析

自1976年我们建立微核检测技术以来, 先后用4种微核测定方法, 开展了对中子测井、铀矿作业人员, 放射性皮炎病人, 医用X射线工作者, 一次X射线胸透后的受检者, 正常健康人以及用不同方法制备微核对正常健康人等的外周血淋巴细胞微核进行研究, 结果如下。

2.1 接触射线人员外周血淋巴细胞微核率的研究

从表 1可看出以上7种观察对象中, 其外周血淋巴细胞微核率均显著高于正常对照者(正常值见后面表 2), 差异非常显著(P＜0.01)。

用MC法测定的正常人经一次X射线胸透对人体外周血微核的影响^[6], 结果表明, 胸透前微核细胞率为0.26 ‰, 胸透后微核细胞率为0.52 ‰, 胸透前后微核细胞率相比较差异有非常显著性(P＜0.01)。医疗照射主要来自X射线医学检查, 为减少电离辐射对人类的危害, 必须减少不必要的医疗照射, 同时在符合医疗照射前提下, 剂量应限制到最低水平。

在培养法测定的工业探伤人员外周血微核率为3.50 ‰^[7], 而正常对照为1.17 %, 用胞质分裂阻滞微核法(CB法)测定介入放射工作者的外周血淋巴细胞微核率为16.5 ‰, 而正常对照者为8.7 ‰, 以上差异均有非常显著性(P＜0.01)。

2.2 正常健康人外周血淋巴细胞微核率的测定

从表 2可知, 用明胶法和MC法测的微核细胞率均值范围为0.2 ‰~0.3 ‰。上述结果和上海医科大学杨家宽教授提出的建议完全一致, 即用明胶法和MC法测的国人微核均值为0.1 ‰~0.3 ‰, 正常值范围为0 ~1.0 ‰, 达到1.5 ‰或超出1.5 ‰者应视为异常^[10]。

3 国内诸作者采用的微核测定方法近况

表 3中, 收集了《中国辐射卫生》杂志自1995年以来刊出的诸作者采用的微核测试方法, 以上所分析的几种测试方法, 如明胶法, MC法, 培养法和CB法等是我国自70年代以来用得最多的微核测试方法。MC法使用简便, 试剂易得, 而且所得结果基本一致, 不需新鲜配制, 不需搅拌, 和血混合即可, 配制一次放冰箱保存备用, 至少可用半年以上, 成功率高。明胶法也有MC法优点但需新鲜配制, 在室温较低时易凝固, 如需用不停地搅拌去纤维蛋白, 费时, 一旦不及时搅拌易凝固导致失败。培养法比明胶法和MC法更灵敏, 是测定经转化的淋巴细胞, 是80年代被广泛采用的方法。CB法是1995年Fenech和Morley^[11]提出的, 此法克服了常规培养法不能识别第一次有丝分裂细胞的不足, 使其用来估算剂量更加可靠, 在我国90年代初(1994年)开始应用于实际。CB法有其上述优点, 但由于松胞素B价格昂贵, 诱发的本底值高, 难以广泛使用。

表 3中收集的21篇文章中, 所采用的微核测试方法用的最多的是培养法, 其次是CB法, MC法。而骨髓嗜多染红法仅用于动物。