中国辐射卫生  2000, Vol. 9 Issue (3): 137-138  DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2000.03.005

引用本文 

王明锁, 杜泽吉, 杨占山, 汪涛. 耐辐射菌的辐射抗性与其核内DNA结合蛋白相关性研究[J]. 中国辐射卫生, 2000, 9(3): 137-138. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2000.03.005.
WANG Ming-suo, DU Ze-ji, YANG Zhan-shan, et al. Relateness of radioresistance and nuclear DNA-binding protein in deinococcus radiodurans[J]. Chinese Journal of Radiological Health, 2000, 9(3): 137-138. DOI: 10.13491/j.cnki.issn.1004-714x.2000.03.005.

基金项目

中国核工业总公司科研基金资助课题(J94Q62068)

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收稿日期：1999-11-24
修回日期：2000-01-13
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耐辐射菌的辐射抗性与其核内DNA结合蛋白相关性研究
王明锁 , 杜泽吉 , 杨占山 , 汪涛     
苏州医学院放射医学系, 苏州 215007
收稿日期：1999-11-24；修回日期：2000-01-13
基金项目：中国核工业总公司科研基金资助课题(J94Q62068)
作者简介：王明锁(1942~), 男, 江苏金坛人, 副教授, 主研辐射损伤与防护等.
摘要：本文采用地高辛(DIG)标记染色体DNA作为探针, South-Western印迹法检测DNA结合蛋白(DBP), 对耐辐射菌D. radiodurans的DBP进行N-末端氨基酸序列分析。研究结果表明:在野生型耐辐射菌中存有八种DBP的特征蛋白(它们的分子量分别为122, 93, 33, 29, 16, 15, 14和12kDa); 经氨基酸序列分析发现其中93kDa和33kDa可能为新的蛋白质; 这两种新DBP的表达水平随培养基和培养时间的不同而异。提示耐辐射菌的DBP, 尤其是93kDa和33kDa的DBP与其辐射抗性可能有密切关系。
关键词：耐辐射菌    Deinococcus radiodurans    DNA结合蛋白    氨基酸序列    辐射抗性    
Relateness of radioresistance and nuclear DNA-binding protein in deinococcus radiodurans
WANG Ming-suo , DU Ze-ji , YANG Zhan-shan     
Department of Radiation Medicine Suzhou Medical College, Suzhou 215007, China
Abstract: The exploration of the role of DNA-binding proteins (DBPs) from a radioresistant bacterium i.e. Deinococcus radiodurans(D. radiodurans).The DBPs from three wild type of D. radiodurans i.e.MR1, KR1 and Sark were determined by south-western bloting using the chromosomal DNA labeled with digoxin as a probe, and the N-terminal AA sequence of some DBPs was analysed.Results showed that there are 8 kinds of characterictic DBPs in the wild types of radioresistent bacterium whose molecular weights were 122, 93, 33, 29, 16, 15, 14and 12 kDa, among whom, the DBPs of 93 and 33kDa from wild type of KR1 were found to be novel proteins by the AA Sequence analysis.The expression levels of the two DBPs change with different culture media at different culture time.It was suggested that the DBPs, especially the DBPs of 93 and 33 kDa, were closely related to the radioresistance of D. radiodurans.
Key words: radioresistant bacterium    deinococcus radiodurans    DNA-binding proteins (DBPs)    amino acid (AA) sequence    radioresistance    

耐辐射菌Deinococcus radiodurans是一种微小的球菌, 由于其对电离辐射和许多化学诱变剂都具有极强的抗性[1], 近年来倍受放射生物学家的关注, 且普遍认为该菌的辐射抗性缘自于其有超常的DNA修复系统[2]。尤在含DNA修复酶类等蛋白质中, 其中能与DNA结合者称之为DNA结合蛋白(DNA-Binding Protein, DBP)表现为甚。以往的研究已表明DBP含量与DNA的损伤和修复的功能密切相关, 但关于耐辐射菌的DBP及其在耐辐射分子学组成特性等的研究目前报道甚少。本文拟在DBP的组份与辐射抗性的相关性方面作一初步探讨。

1 材料和方法 1.1 细菌株及培养条件

耐辐射菌(Deinococcus radiocluras)为野生型的MR1、KR1和SarK三种; 大肠杆菌(E.coli)为JM109, 嗜热菌(T.thermophilius)为YT1; 枯草杆菌(B.Subtilis)为RM125。TGY培养基: 0.5%胰蛋白胨(Difco), 0.1%葡萄糖, 0.3%酵母提取物(Difco)。LB-L培养基: 1 %胰蛋白胨, 0.5%酵母提取物, 0.5 %NaCl。TM培养基: 0.4%胰蛋白胨, 0.2%酵母提取物, 0.1NaCl。耐辐射菌, 嗜热菌分别生长在TGY、TM培养基中, 培养温度分别为30 ℃和65 ℃。大肠杆菌和枯草杆菌生长在LB-1培养基中, 培养温度为37℃。

1.2 菌体蛋白粗提物的制备

培养一定时间后的各种细菌, 离心收获、磷酸盐缓冲液(PBs)洗两次, 4 ℃下经超声破碎, 低温离心(1500r·min-1) 30min, 收集上清液备用。

1.3 染色体DNA的分离及地高辛(DIG)标记DNA探针的制备

按Saito等[3]方法分离纯化耐辐射菌DOVA。纯化后的DNA经内切酶Sau3A1(Takara.Jp)部分消化, 继之用DIG标记试剂盒(Takara), 按其说明书陈述步骤制备DIG标记的DNA探针。

1.4 South-Western印迹法检测DBP

细菌的蛋白提取物经SDS-PAGE后, 转印到PVdF(聚偏二氟乙烯)膜上(4℃, 150mA, 90min), 按照South-Western印迹法检测试剂盒(Takara)的使用说明, 进行DBP的检测。其简要过程为:结合, 缓冲液洗膜, DIG-DNA探针与膜温育, 标记碱性磷酸酶(AKP)的抗DIGDNA结合, AKP与其底物NBT进行显色反应, 最后对信号加以检测。

1.5 氨基酸(AA)序列分析

采用Edman' s降解法, 取其PTH-AA衍生物在N-端AA自动测序仪(470A型, ABI公司)上进行分析。将上述AA编码序列输入NCBI数据库, 采用BLAST[4]和FASTA[5]软件, 对已知蛋白质的AA序列与已知数据库作同源性分析。

2 结果 2.1 野生型耐辐射菌、嗜热菌、大肠杆菌及枯草杆菌等四种菌株DBP的检测

取培养48h后的细菌培养物, 经South-Western印迹法检测所得DBP结果见图 1。

图 1 野生型耐辐射菌的DBP

由图 1显示出三种野生型的耐辐射菌(MR1, KR1, SarK)均可检测到八种DBP, 它们的分子量分别为: 122, 93, 33, 29, 16, 15, 14和12kDa。而在嗜热菌、大肠杆菌中均没有检测到相应的DBP, 枯草杆菌在33kDa处可检测到一个弱信号。

2.2 93kDa和33kDa两种DBP的N-末端氨基酸序列分析

取经TGy培养48~72h后的耐辐射菌KR1, 制备蛋白提取物, 93kDa和33kDa蛋白区带各取4~6个平行样, 作N-末端氨基酸序列分析, 其结果如下:

93kDa: MLKEDAARKTYVSPAVWEGCGREKFPVLNS

33kDa: MWPFGKSTADRVKDAFKANPVLAPLGGEVQ—

在已知的数据库中, 均未找到各自的同源序列, 表明这两种DBP有可能是新的蛋白质。

2.3 不同培养基和培养时间对耐辐射菌DBP表达水平的影响

野生型耐辐射菌KR1分别培养在两种培养基(TGY, LB-1)中, 并在不同时间(8, 13, 18, 24和48h后)收获细胞, 经检测, DBP的实验结果(图 2)表明, 不同培养基及不同培养时间对两种DBP(93kDa, 33kDa)的表达水平有明显影响。就野生型KR1的93kDa DBP在低于24h内的表达水平而言, 选用LB-L培养基明显高于其在TGy培养基中的表达水平, 它们均随着时间的延长而增高。应指出的33kDa DBP需待48h培养后仅仅在TGY培养基中表达, 其水平也随着培养时间延长而增高。

图 2 培养基和培养时间对耐辐射菌KR1的DBP表达的影响
3 讨论

耐辐射菌D.radiodurans能够抗较大剂量的辐射及其它化学损伤剂的毒害, 一般认为这种细菌的耐辐射性与其本身具有高效而准确的DNA修复系统所决定。据报道[6]迄今为止, 只有四种与辐射相关的蛋白基因被克隆, 即recA, polA, uvrA和pprA。前三种基因产物分别与大肠杆菌的RecA蛋白, DNA聚合酶工和Uvr蛋白具有同源性, 而pprA基因是一个新分离出来的能促进DNA修复的基因, 尚未发现与其产物具有同源性的蛋白质。Kitayama等研究[7]指出, D·radiodurans的耐辐射性与其核内DNA的特异结构与组成有关。在耐辐射菌中DNA的G+C的含量约占70 %, 并有部分蛋白参与DNA分子构象的稳定性, 使DNA较易被修复, 而这些蛋白大多呈DBP形式存在。大肠杆菌中的DBPⅡ是研究得最多的一种。本文从三种野生型D.radiodurans中检测到八种DBP, 并和其他的三种细菌对照比较, 发现这些DBP似平均为耐辐射菌所特有, 特别是93kDa, 和33kDa这两种新蛋白, 推测其在耐辐射菌的辐射抗性中占有重要地位。由于其N-末端AA序列已被阐明, 则可以通过制备寡核苷酸探针, 并从D.radiodurans的DNA基因库中筛选出编写该DBP基因的DNA片段, 进而加以克隆, 这样便可通过辐射所致离体定向诱变法来进一步探讨DBP的放射损伤及防护的作用及其机制。

研究已表明[8], 耐辐射菌D.radiodurans在正常的培养基中(TGY, 30℃), 在指数生长期, 90 %呈二联体, 稳定生长期绝大多数呈四迭体形态。至于LB-L培养基对该耐辐射菌是“过营养”, 即全优条件, 细菌的倍增时间缩短, 形态且有改变, 比如细胞体积增大, 多联体细胞的比例增高等。但就辐射的耐受性而言, 生长在LB-L全优培养基中却低于生长在TGY次优培养基中。除形态上造成的差异外, 本研究已清楚表明DBP表达水平因不同培养基而异, 例如93kDa DBP在两者培基中均表达, 而33kDa DBP只是在次优条件TGy中表达, 所以, 耐辐射菌具有的严谨反应的本能也是造成辐射抗性较高的另一种主要原因。

参考文献
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Kitayama S, Matsumura O, Masuda S. Isolation of a DNA-binding protein from Deinococcus radiodurans have an affinity for a Z-form polynucleotide[J]. J Biochem, 1988, 104(1): 127-130.
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Du Zeji, Takahashi Y, Narumi I. The morphology and the growth characteristics of Deinococcus radiodurans[J]. Acta Academiae Medicinae Suzhou, 1998, 18(11): 1131-133.