低剂量电离辐射可增强机体的免疫功能^[1], 亦可诱导机体的免疫适应性反应^[2]。转铁蛋白受体(TfR)是T淋巴细胞活化和增殖过程中表达在细胞表面的重要膜受体, 与T淋巴细胞的活化和增殖有着蜜切关系。目前尚未见国内外有关辐射诱导TfR表达适应性反应的研究报道。本文采用直接免疫荧光流式细胞术方法检测了低剂量X射线全射照射对TfR表达的影响及诱导TfR表达的适应性反应, 以探讨低剂量电离辐射诱导机体产生免疫适应性反应过程中TfR表达的变化及作用。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康雄性昆明小鼠, 体重20±2g, 购自白求恩医科大学实验动物部。动物随机分为对照组和不同剂量照射组。

1.2 照射条件

Philips深部X射线治疗机, 电压200kV, 电流10mA, 滤板0.5mmCu和1.0mmAl, 低剂量照射组给予25, 50, 75, 100, 200mGy全身照射, 剂量率12.5mGy/min, 靶皮距212cm; 2Gy组全身照射, 剂量率0.287Gy/min, 靶皮距50cm; 75mGy +2Gy组, 先给予75mGy全身照射, 6h后再给予2Gy全身照射; 对照组给予假照射。

1.3 TfR表达的诱导

不同剂量照射组动物, 于照后24h断头处死; 75mGy+2Gy照射组动物, 在75mGy照射后24h断头处死。在无菌条件下取出脾脏, 放入盛有RPMI-1640培养液的平皿中, 用毛玻片研磨制成单细胞悬液, 离心1000转/ min, 4 ℃, 5min, 弃上清, Hanks液洗细胞两次。加5ml Tris-NH4Cl, 作用5min, 裂解红细胞。Hanks液洗细胞两次, 将细胞重悬于含10 %NBS的RPMI-1640培养液中, 调细胞浓度为1×10⁷个/ ml。无菌24孔培养板, 每孔100μl细胞, 加含850μl 10 %NBS的RPMI-1640培养液, 加50μl浓度为100μg/ml的ConA(Sigma, 美国), 37℃, 5%CO₂孵箱中培养48h。

1.4 TfR表达的检测

采用直接免疫荧光流式细胞术, 美国B-D公司生产的FACScan流式细胞仪进行检测。上述培养48h的细胞, 用0.01M PBS洗涤两次, 离心1500转/min, 4 ℃, 5min, 细胞重悬于150μl 0.01MPBS中, 加4μl FITC-抗小鼠TfR单克隆抗体(Sigma, 美国), 4℃, 反应45min, 0.01MPBS洗涤两次。用FACS软件收集细胞, Ly sys软件分析处理数据, 每个样品收集10000个细胞, 记录阳性细胞百分率。

1.5 统计学处理采用studnet' s t检验 2 结果 2.1 低剂量X射线全身照射后脾脏淋巴细胞TfR表达的变化

0, 25, 50, 75, 100及200mGy X射线全身照射后24h, 小鼠脾脏淋巴细胞数及TfR表达阳性细胞数的检测结果见表 1。不同低剂量X射线照射后, 小鼠脾脏TfR阳性细胞数在75mGy组显著增高, 与对照组比较差异显著(P < 0.05)。

2.2 低剂量照射诱导TfR表达的适应性反应

采用75mGy作为适应性反应的诱导剂量, 2Gy作为攻击剂量, 两次照射间隔6h, 诱导TfR表达适应性反应的结果见表 2。从表中可以看出, 脾脏TfR阳性细胞数2Gy组显著低于对照组(P < 0.01), 75mGy +2Gy组脾脏TfR阳性细胞数显著高于单纯2Gy照射组, 表明75mGy照射可诱导脾细胞TfR表达的适应性反应。

3 讨论

已有研究表明, 低剂量电离辐射全身照射能够明显减轻其后1.5Gy全身照射对小鼠胸腺及脾脏免疫功能的抑制, 诱导免疫适应性反应^[3]。辐射诱导免疫适应性反应不仅与辐射的诱导剂量(D₁)有关, 而且与攻击剂量(D₂)和D₁与D₂二次照射间隔时间的长短有关^{[3, 4]}。为确定最佳诱导剂量(D₁), 我们首先检测了25 ~ 200mGy低剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达的影响, 看到75mGy全身照射可增强脾细胞TfR的表达, 故选择75mGy作为TfR表达适应性反应的诱导剂量。大剂量X射线全身照射对小鼠脾细胞TfR表达影响的研究显示, 1Gy及以上的剂量照射明显抑制TfR的表达(另文报道); 亦有报道当D₂超过2Gy时, 低剂量X射线全身照射不再诱导丝裂原刺激的脾细胞增殖反应的适应性反应, D₁与D₂时间间隔6h时, 可诱导丝裂原刺激的脾细胞增殖反应的适应性反应^{[3, 4]}, 因而我们选择了2Gy作为攻击剂量, 6h为D₁与D₂的间隔时间。实验结果表明, 75mGyX射线全身照射可明显减轻其后2Gy照射对小鼠脾细胞TfR表达的抑制作用, 诱导出TfR表达的适应性反应。研究表明, 静止的T淋巴细胞不表达TfR, 受到丝裂原刺激后, 在IL-2及IL-2受到相互作用诱导下表达TfR, 细胞进入S期。TfR在T淋巴细胞增殖过程中发挥着重要作用^{[5, 6]}。我室以往研究证实, 低剂量辐射可诱导丝裂原刺激的脾细胞增殖反应的适应性反应, 本研究75mGyX射线全身照射可诱导TfR表达的适应性反应, 说明TfR表达可能在脾细胞增殖反应的适应性反应中发挥作用。我室对75mGyX射线全身照射后4h小鼠脾淋巴细胞核和胞浆中蛋白提取物进行研究, 发现其中某些蛋白组分可使正常脾细胞对ConA的反应增强, 而且这些蛋白的分子量多在100kDa以内。TfR的分子量是95kDa, 深入研究包括TfR在内的这些蛋白在辐射诱导免疫适应性反应中的作用, 将有助于低剂量辐射诱导免疫适应性反应机制的阐明。