Fenech和Morley(1985)^[1]提出的CB微核法, 克服了常规培养法不能识别第一次有丝分裂细胞的不足, 使其估算受照剂量更加可靠。并已有实际应用的报道^[2~4], 都取得了较为满意的结果。为使该方法更加完善, 学者们对CB微核估算受照剂量的影响因素进行了大量的研究。本实验是在原来工作的基础上^[5], 进一步观察x射线诱发微核的剂量率效应。

1 材料和方法 1.1 血样和照射条件

血样来自半年内无射线和化学毒物接触史的两名健康成年男子。把从每人抽取的10ml肝素化静脉血分装于5只灭菌玻璃管中, 密封, 1管作对照, 其余4管在37 ±0.5℃条件下以x射线进行不同剂量率(0.1, 0.4, 1.0和2.0Gy/ min)的一次照射, 总剂量为2Gy。照射剂量由卫生部标准剂量实验室提供, 照射用MG324x射线机, 管电压为240kV, HVL为0.3mm Cu。

1.2 培养、制片和观察

将对照和受照血样在37 ±0.5℃恒温放置90分钟后, 从每管取出0.5ml加入培养体系(RPM I1640液3ml, 新生牛血清1ml, 青链霉素各100u/ml, PHA适量)中, pH7.2~7.4, 混匀后置37±0.5℃恒温箱中, 培养至40小时加松胞素-B。先将松胞素-B溶于二甲基亚砜中, 配成2mg/ml的储藏液, -20℃保存, 用前融化, 生理盐水稀释, 在培养体系中的最终浓度为6μg/ml, 避光培养到70小时收获。先吸出上清液, 往沉淀物中加4ml 0.075mol/L KCl, 混匀后立即加新配的固定液(甲醇:冰乙酸=3:1)4ml, 混匀并移入离心管, 1000rpm离心10分钟, 去上清, 重复固定一次, 离心后沉淀物涂片, Giemsa染色。

采用盲法阅片。观察胞体较大、胞质丰富的双核淋巴细胞并记录其微核。微核的判断标准是游离于胞质中, 与主核完全分开, 如有重叠或相切必须看到各自的完整核膜, 呈圆形或椭圆形, 结构与主核相同, 着色与主核一致或略浅, 不析光, 大小为主核的1/3以下。结果以微核细胞率(‰)和微核率(‰)表示。

2 实验结果

本研究共观察了18000个双核CB细胞, 将结果列于表 1。从表 1可见, 对照微核细胞率及微核率皆为5.5‰, 在正常范围内。在总剂量相同(2Gy)条件下, 微核细胞率和微核率, 除0.4Gy/min和1.0 G y/min两点接近外, 其他各点随剂量率增加而增加。最小剂量率(0.1Gy/min)点与其他各点的微核细胞率, 经x²检验差异有非常显著性意义。0.4Gy/ min和1.0G y/min微核细胞率间无显著性差异, 0.4Gy/min和2.0Gy/min之间、1.0Gy/min和2.0Gy/min之间微核细胞率差异非常显著(见表 2)。

按常用的数学模式, 对微核率与剂量率间关系进行曲线拟合, 并检验回归系数的显著性及拟合度(相关指数-R²)。结果列于表 3。

从表 3可见, 回归方程式(1)、(2)和(4)的回归系数不显著(P >0.05), 回归方程式不能成立, 而回归方程(3)的回归系数显著(P=0.05), 相关指数也较接近于1, 故(3)为最佳方程式。

综上所述, 属于低LET辐射的X射线诱发微核的产额具有明显的剂量率效应。在本实验条件下, 微核率与剂量率间的关系为幂函数(ŷ=kXⁿ)。

3 讨论

照射的时间因素对电离辐射生物效应具有相当重要意义。在一般情况下, 剂量率越大, 生物效应越高, 但当剂量率达到一定程度时, 生物效应和剂量率之间则失去这种比例关系。

已证明在低LET辐射照射时, 剂量率对染色体畸变剂量效应曲线的影响有严格的定量关系, 并可互相推导。微核有无剂量率效应及分次照射的剂量效应关系等引起学者们的关注。本实验室(1991, 1992)^{[5, 6]}用⁶⁰Coγ射线照射离体人血和家兔分别研究了CB双核细胞微核的剂量率效应和分次照射的剂量效应关系, 结果表明:(1)总剂量3Gy, 剂量率0.05~3.01Gy/min的⁶⁰Coγ射线照射离体血, 诱发的微核具有明显的剂量率效应, 微核率与剂量率间关系适于幂函数(ŷ=1018, 1224X0.2057, ŷ为微核率‰, X为剂量率G y/min); (2)总剂量3Gy, 剂量率0.387Gy/min的60 Coγ射线一次和间隔不同时间(15、45、90、120和180分钟)分次(1.5G y +1.5Gy)照射离体人血。一次照射3Gy组微核率明显高于总剂量相等的各分次照射组, 差异有显著性意义; 分次照射组微核率随分次照射间隔时间延长而降低, 呈负相关; 当间隔时间延长到120分钟后, 微核率处于稳定水平; (3)用⁶⁰Coγ射线一次和分次照射家兔时, 照后微核率随剂量增加而增加, 相应剂量点微核率分次照射低于一次照射, 当4Gy时差异有非常显著性意义。

与此同时, Vral等(1992)^[7]用X射线照射离体人血研究微核的剂量率效应和分次照射的剂量效应关系。结果表明, 高剂量3G y和4Gy照射, 剂量率低于1.6G y/h时, 微核产额显著降低, 而剂量率为1G y/h, 未见剂量率效应。曲线拟合适于二次多项式(ŷ=a+bD+CD²)。在分次照射研究中, 用4名供体外周血一次性4Gy或2 +2Gy分次照射, 时间间隔从30秒至10小时, 结果照射的间隔时间Δt与微核率呈幂函数关系, 随时间延长微核产额持续减少, 即初期快速降低后, 进而出现轻度减低。

本研究用240kV X射线照射离体血, 总剂量为2G y, 剂量率从0.1G y/min到2.0Gy/min, 最大是最小的20倍, 见到明显的剂量率效应, 回归方程适于幂函数。本次实验结果与我们过去的研究及Vral等结果基本一致。表明低LET辐射诱发的微核具有显著的剂量率效应。因此, 在建立低LET辐射照射诱发微核的剂量效应曲线时, 必须选择大小几个不同的剂量率, 建立几条刻度曲线。在估算事故受照人员的剂量时, 应选择剂量率接近的曲线。笔者认为, 随着研究的不断深入和资料的积累, 有可能找到低LET辐射照射剂量率对微核剂量效应曲线影响的定量关系, 通过引进某一修正系数或函数, 使一条刻度曲线能用于各种剂量率事故受照者的剂量估算, 不过这是一个难度很大的问题。