氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(³H-TdR)是一种极为重要的有机氚结合形式, 它是DNA合成的前体物, 在基础医学研究中得到了广泛的应用。³H - TdR发出的粒子是已知能量最弱的软β粒子, 在体内滞留时间较长, 甚至可以终生滞留, 因此³H -TdR引起内污染的可能性有所增加^[1], 从而引起了人们的重视, 而研究³H -TdR的生物学效应的一个重要前提就是准确的内剂量估算, 因此建立一种内剂量估算方法具有一定的意义。

1 材料与方法

用RPIM 1640制备C_5T小鼠脾细胞悬液, 经细胞计数后, 调整细胞浓度, 每毫升培养液中含10⁶个脾细胞用于实验。

1.1 细胞核直径的测量

细胞经固定、染色后, 由于处理过程中的多种原因^[2], 致使所观察到的细胞核直径是不可靠的。根据经验得知, 先测量活细胞的直径, 再测量固定了的细胞直径d_c和核直径d_n, 可间接推算活细胞核直径。

d_c/d_n比例测定制备脾细胞悬液, 甲醇:冰醋酸3:1固定10分钟, 再滴片, 自然干燥, 苏木精一伊红染色, 高倍镜下观察细胞直径d_c和核直径d_n。

活细胞直径的测量向微量脾细胞悬液中加入1滴0.4%台盼兰染色液, 滴一滴于载玻片上, 放上盖玻片, 高倍镜下观察并计算活细胞直径。

1.2 细胞标记指数的测量

向细胞悬液中加入40μg PHA, 培养24小时后, 加入3.7 ×10⁴Bq³H - TdR, 再培养24小时; 冰水中终止掺入, Hanks液洗细胞4次, 将标记了的脾细胞滴在干净的载玻片上, 涂片, 自然干燥, 冰醋酸:甲醇(3:1)固定10分钟, 自然干燥, 涂乳胶, 暗室曝光3天, 显影、定影、苏木精一伊红染色, 镜下观察被标记的细胞数。

1.3 ³H -TdR在细胞内的动态掺入

测量不同掺入时间内, 每10⁶个细胞核内掺入的³H -TdR的每分钟计数(cpm), 经计数效率校正后, 换算为每个细胞核内的平均活度, 所得结果经涂开成等所设计软件处理^[3], 可得到培养液中³H -TdR活度为7.4 × 10⁴Bq时, 由24小时至52小时标记时间范围内的累积活度Ã。

1.4 培养液中不同活度的³H -TdR掺入曲线的测定

培养液中加入不同活度的³H -TdR, 按本文(1.3)所述方法即可求出不同活度的³H -TdR掺入曲线。

2 结果

经测量, 活细胞的直径为10.7 ±1.4μm, 而固定了的细胞核直径和细胞直径之比为d_n/d_c= 0.6, 因此细胞核直径可用下式算出(10.7 ±1.4)× 0.6=6.5 ±0.9μm; 本文所用剂量估算方法的另一个较重要参数即淋巴细胞标记指数, 经实验计算后为0.93。

³H -TdR动态掺入实验结果列于下表 1:

上述结果, 参照涂开成等设计的自动挑选数学模型的回归分析方法^[3], 将掺入时间及³H -TdR掺入量两组数据进行统计学的回归分析, 通过在计算机上自动挑选理想模型, 从其中的20个数学模型中挑选了编码为10的模型, 即Y=868.73/[1 + 619.47 exp (-7.78E-0.2X)], 直线化后的相关系数为0.97, 式中Y为培养时间为t(小时)的³H - TdR掺入量(mBq/cell -DNA)。

由24小时至52小时标记时间范围内的累积活度即对上式求24小时至52小时的积分:

随着培养液中³H -TdR活度的升高, 细胞核的DNA³H -TdR掺入量有增加趋势, 实验结果以³H - TdR活度为横坐标, 反映掺入量高低的cpm值为纵坐标, 绘制曲线(附图)。

体外培养的细胞径³H -TdR标记后, 细胞核的平均吸收剂量可按下式计算^[4]:

式中, ε_n为每个核吸收的平均能量, m_n为细胞核质量, f为由于边缘效应而为核内沉积氚释放能量被核所吸收的份额, 此处采用0.8, 事实上, 研究培养细胞核平均吸收剂量时应包括两部分, 即培养液中核素贡献部分和掺入细胞核内核素贡献部分, 对于低能β³H而言, 因其能量较低, 本文只考虑了结合³H部分, K为单位转换系数, 62.5 ×10⁸M eV·g^-1 =1Gy; 而ε_n=Ã × ε_β, Ã为累积活度(mBq ·h), ε_β为β粒子的平均能量, 即5.7 ×10^-3M EV/dis; 细胞核的质量为m_n,

, 细胞核比重ρ取1g/cm³, 代入细胞核直径6.5 μm后, 得出m_n=1.4 ×10^-10g

式中Ln=10⁶为细胞指数, L_f=0.93为细胞标记指数。

根据培养液中³H -TdR 7.4 ×10⁴Bq/ml条件下的累积活度, 可算出其相应的吸收剂量为

由于A₁:A₂:A₃:… …=Ã₁:Ã₂:Ã₃ … …

这样就可推算出各种比活度相应的累积活度, 从而估算出相应的吸收剂量, 结果见表 2。

3 讨论

由于基础医学研究用³H及人类和平利用原子能, 自然环境中核素的存在有增加趋势, 因此, 为研究辐射损伤效应提供内剂量估算显得十分必要。从实验数据看, 随着培养液中³H -TdR用量的增加。细胞核的³H -TdR的活度并不成比例地增加。据文献^[2]报道, ³H -TdR浓度的增加, 可导致细胞的死亡, 从而影响了细胞核的吸收。

通常β内剂量估算是在放射性核素组织均匀分布和组织体积大于β粒子最大有效射程条件下, 采用"质量平均法"而得出的; 对于单个细胞核来说, β粒子的相当多的能量因"边缘效应"而逸出其结构, 因此"质量平均法"不适用于β内剂量的估算^[5]。累积活度一定时, 核半径越小, 边缘效应越大, 致使核剂量变小, 本文利用经验推算细胞核直径以及内剂量估算过程中所做的不同活度掺入曲线, 在一定程度上较为准确地考虑了"边缘效应"的影响。另外, 我们发现必须做不同活度的³H -TdR的掺入水平研究, 才能较为准确地测定各辐射情况下的终点掺入量。

有机结合氚的辐射损伤剂量一效应关系研究中经常可以看到, 不同实验室所得到的结果有所不同, 其原因之一就是氚的内剂量估算方法各异, 通过比较研究各种计算方法, 建立一种较为准确的方法, 是十分必要的。